利用实验设计与自动化工作流程实现基因编码生物传感器设计空间的高效采样

我们的研究重点是面向生物技术应用的生物传感器的开发与优化。具体而言，我们旨在通过调控生物传感器的遗传元件，来理解如何对其进行优化与设计。基于经验直觉的设计方法，例如经典的启动子工程和荧光激活细胞分选，是生物传感器表征与设计中常规应用的技术。

实验设计方法尚未在基因回路设计中得到广泛应用。通过本方案，我们旨在提高这些技术在基因回路和生物传感器设计中的采用率。首先，确定理论文库规模，并计算为确保超过95%文库覆盖率所需构建的独立变体数量。

根据需要筛选的菌落数量，计算所需含抗生素的溶菌肉汤培养基的体积。打开液体处理仪软件，点击MTP液体转移程序旁边的运行。将准备好的培养基放入相应的储液槽位置。

然后根据布局用空的微孔板填满板架。将程序设置为分配 200 µL 培养基。单击“确定”以确认程序开始。

现在，将已加样微孔板的孔转移至菌落挑取仪平台，并打开密封后，将含有质粒变异文库DNA转化的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的方形螺旋板转移至菌落挑取仪平台中。使用菌落挑取仪从转化子平板上挑取单个菌落，接种至各预加样孔中。重新密封接种后的微孔板，并将其转移至离线振荡培养箱中。

孵育结束后，将培养好的平板放回液体处理仪平台并打开密封。点击“向MTP中添加甘油”程序旁边的运行按钮。确保屏幕上显示的平板布局与液体处理仪对接端口的布局一致。

然后依次点击“确定”以运行程序。程序结束后，密封培养板，并在离线摇床培养箱中以每分钟800转的速度短暂混匀5分钟。对培养板进行条形码标记，并于-80摄氏度保存，直至后续使用。

计算深孔板所需的含抗生素培养基体积。点击深孔板液体转移程序旁边的运行按钮。确保将培养基加入正确的储液槽中。

确保空的深孔板已放置在正确的布局位置，并且吸头供应充足。将程序设置为分配 495 µL 培养基。准备就绪后，依次点击“确定”以启动程序。

现在，用透气膜密封已加样的深孔板，并转移至4°C条件下临时保存。接下来，点击“从解冻的MTP程序接种”旁边的运行按钮。确保按照布局将MTP冷冻保存液和已填充的深孔板转移至平台，并装载足量的吸头。

依次点击“确定”以开始初始化。程序完成后，使用透气膜密封已接种的过夜深孔板模块，并将其转移至离线平板摇床培养箱中，在30摄氏度、800转/分钟、75%湿度条件下培养16小时。

重新密封，混匀，并将冷冻保存用微量滴定板放回-80摄氏度冰箱。接下来，计算用于过夜培养待筛选深孔板所需的、添加了不同效应物和抗生素浓度的培养基体积。点击深孔板液体转移程序旁边的“运行”按钮。

然后确保已正确放置添加了效应物的培养基储液槽。将空的深孔板放入液体处理平台中。当有足够数量的吸头可用时，依次点击“确定”以启动程序，生成用于检测的深孔板。

加样完成后，使用透气膜密封检测用深孔板。将空板重新装入液体处理仪，重复接种操作，直至所有检测用孔板均被填满。

接下来，点击“转移至检测用深孔板程序”旁边的运行。在将添加效应物的培养基的检测用深孔板正确放置并去封后，按照布局依次转移并打开含有培养过的恶臭假单胞菌（P. putida）的过夜深孔板。随后依次点击确定以启动程序。

程序结束后，将转移测定板密封并放入离体培养箱中。接种后丢弃过夜培养的深孔块。接下来，将深孔块放入离心机中。

在18摄氏度下，以4,000 G的离心力在预冷的转子中离心5分钟，沉淀细胞。弃去上清液后，将深孔板放置于液体处理平台。根据待筛选的深孔板数量，计算所需一倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）的体积。

点击运行邻近检测设置 PBS 重悬 DWB 程序旁边的“运行”按钮，并将分配体积设为 500 微升。然后确保将 PBS 加入正确的储液槽中，并根据布局排列离心后的板。确认吸头可用后，点击“确定”以启动程序。

重新密封并从液体处理仪中取出重悬的深孔板。检查板的底部，确保沉淀物已完全重悬。点击检测设置细胞旁的运行按钮，以及PBS版本MTP程序。

然后根据布局将重悬的深孔板转移至液体处理仪中。根据布局加载空的微孔板，并在点击确定前将分配体积设置为 200 µL。将加样后的微孔板转移至离线多功能酶标仪，测定相对荧光强度和 OD600。

对5,000个启动子变异体进行自动化筛选，鉴定出激活水平超过3.6倍的最佳候选序列。绘制100个独特变异体的EC50值，以可视化其敏感性分布并识别出性能稳定的候选序列。对226个富集的变异体计算EC50值，并通过Lin-log转换进行排序，构建具有敏感性梯度的文库。

采用四个模块的 1、0 和 1 水平方差构建了明确的筛选设计方案。转运、调控因子、P-out 和输出核糖体结合位点模型的谱图揭示了这四个模块表达水平的变化如何非线性地影响 EC 50 和希尔系数。通过 RBS-Out 鉴定出最优表达组合，对灵敏度和斜率均表现出显著的正向作用。

通过整合理想模块强度的全球优化生物传感器变体，相较于亲本型和DSD优化型，表现出更高的灵敏度和Hill系数。