使用高通量自动化微型生物反应器系统在CHO细胞中生产模型IgG1

该方法有助于回答生物工艺制造领域中关于细胞系表征以及中间过程和工艺优化方面的一些重要问题。该技术的优势在于，它可在摇瓶中提供更好的控制，并支持自动化操作，能够开展大量小规模研究，从而快速生成数据。本次实验操作将由我实验室的研究员 Sai Rashmika Velugula 和 Casey Kohnhorst 演示。

首先，将一支含有每毫升3×10⁷个冻存细胞的冻存管置于37°C水浴中融化。当仅剩少量冰晶时，轻轻吹打细胞悬液数次，迅速将1毫升细胞转移至含有29毫升OptiCHO培养基的无菌125毫升通气摇瓶中。将摇瓶置于37°C、8% CO₂的细胞培养摇床中，以130 rpm振荡培养。

72小时后，在125毫升旋转培养瓶中加入100毫升新鲜的37摄氏度培养基，继续在37摄氏度、8%CO₂条件下以70 RPM转速振荡培养72小时。传代培养的第三天，向旋转培养瓶中加入新鲜预热的培养基，以维持细胞至少90%的存活率，再继续培养24小时。次日早晨，单击远程桌面图标，然后单击连接。

当远程桌面连接后，打开细胞计数软件并安装新的试剂包。然后清空台盼蓝废液并启动系统。接下来，最小化远程连接，并使用现有实验作为模板打开微生物反应器软件以创建新实验。

开始运行前，在软件的模拟部分定义运行过程中使用的培养板，并在每个培养站中放置12个无菌培养容器。将已灭菌的夹板放在容器上方，再将搅拌板置于夹板之上，确保每个插销都牢固插入。然后，使用提供的螺丝和旋钮固定夹板。

启动系统时，扫描每个培养容器附带的条形码。系统将初始化并检测相应容器是否存在。将温度控制设置为 37 摄氏度，搅拌速度设置为 1,000 转/分钟，并开启溶氧 pH 监测仪。

接下来，执行培养基加注程序。当所有培养基加载完毕后，从消泡剂板向培养容器中加入 35 微升 EX-CELL 消泡剂。30 分钟后开始记录培养基中的溶解氧和 pH 值，并使溶解氧达到 50% 的设定值。溶解氧平衡后，开启背景碱液添加，使所有培养容器的 pH 值达到 7.1 的设定值。

次日早晨，执行暂停的PH步骤，将旋转烧瓶中的全部内容物转移至无菌的250毫升锥形管中进行离心。用足够量的新鲜培养基重悬沉淀，使接种至培养容器后最终密度达到每毫升1×10⁶个CHO细胞，然后将悬浮细胞加入无菌带盖24孔板的相应孔中。每孔加入3毫升接种物，并将接种板放置于生物安全柜内指定的台面上。

然后，让培养容器平衡至少一小时，并在程序中启动五步 EX-CELL 计数。在第二天进行日常营养物质和代谢物分析时，将样本管架板放置在指定的托盘上，并将打开的微量离心管装入相应的管架中。接着，将样本放入分析仪托盘中，以进行营养物质分析。

终止运行时，首先关闭温度控制，然后关闭振荡。停止溶解氧 pH 控制和背景碱液添加，关闭所有其他控制及系统监测。拧开夹具和搅拌板，取出培养容器，并将干燥板拧入培养站。

然后，在程序中执行两小时的干燥循环；干燥循环结束后，点击生物反应器软件中的停止按钮。收集细胞时，将反应器容器中的细胞培养液转移至相应的锥形管中进行离心，并通过无菌的0.22微米PVDH滤器过滤上清液。随后，将每份无菌细胞培养上清液各取1毫升，分别转移至1.5毫升的微量离心管中，于负20摄氏度保存，直至进行滴度分析。

为了测定样品的IgG滴度，首先打开蛋白A生物传感器系统。在光源预热至少一小时后，将样品平衡至室温，并将每个样品对应的蛋白A探针头用新鲜细胞培养基预浸泡至少30分钟。然后，将样品板温度设置为26摄氏度。

将样品加载到系统中，并使用数据采集软件中的默认高灵敏度检测程序进行检测，包括再生步骤。利用集成式细胞计数器，可每日获取所有培养条件下平均活细胞密度和细胞活力。通过营养分析仪，我们还可以获得营养物质和代谢副产物的谱图，从而证明在微生化反应器系统中监测这些参数的可行性。

此外，如本研究所示，可利用蛋白质辅助生物传感器系统对不同培养条件下细胞培养的总生产力进行定量分析。在实施该方案时，需注意该方案仅在编程正确的情况下才有效，因此必须确保各步骤按时执行且尽量减少操作误差。在完成该方案后，还可进一步采用其他方法，如液相色谱、质谱分析和多角度光散射等，以探究所生产产物的物理和化学特性相关的更多问题。