人外周血CD14⁺单核细胞向功能性破骨细胞的分化

0. 本方案描述了一种优化且可重复的体外生成破骨细胞的方法，可用于研究其分化过程及功能相关的机制。该技术的主要优势在于仅需一周时间即可产生大量功能活跃的破骨细胞。通过使用纯化的单核细胞并及时添加细胞因子，可实现高效的分化产量。

破骨细胞负责所有类型关节炎中的骨破坏，该方法提供了筛选能够调节其分化和/或功能的新型治疗化合物的工具。演示该实验步骤的是本实验室的博士研究生 Patricia Riedlova。首先，将血液转移至一个新的 50 毫升离心管中，以分离外周血单个核细胞（PBMCs）。

新鲜血液用无菌 PBS 等体积稀释，白细胞锥体和血沉棕黄层则按 1:3 比例稀释。通过倒置轻柔混匀血液。准备含 3 毫升密度梯度介质的 15 毫升离心管，并将 8 至 10 毫升稀释后的血液缓慢铺加在密度梯度介质上方，避免混合。

将离心管在室温下以 400 × g 离心 30 分钟，不使用刹车。然后用巴斯德移液管小心弃去上层液体。收集下方含有 PBMCs 的中间层，并将此层转移至新的 50 毫升离心管中。

用无菌 PBS 将细胞悬浮至最多 50 毫升，通过在室温下以 300 × g 离心 10 分钟（使用全制动）去除残留的密度梯度介质。为去除残留的血小板，重复文中所述离心步骤，将分离纯化的 PBMC 重悬于 20 毫升 PBS 中，并按照标准方法使用血细胞计数板进行计数。为富集 CD14+ 单核细胞，将 1 × 10⁷ 个 PBMC 转移至合适的聚苯乙烯圆底管中，在 300 × g 离心 5 分钟以形成细胞沉淀。

弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于细胞分离缓冲液中，每100微升细胞悬液加入10微升抗体混合物，盖上盖子孵育10分钟。孵育结束后，每100微升细胞悬液加入10微升磁性纳米颗粒珠，盖上盖子孵育3分钟。最后用细胞分离缓冲液补总体积至2.5毫升。

将离心管放入磁力架中，开盖孵育3分钟。此时离心管仍置于磁力架上，通过一次连续的倒置操作弃去阴性细胞群体。从磁力架中取出离心管，用2.5毫升细胞悬浮缓冲液重悬磁珠吸附的富集CD14+单核细胞，然后将离心管重新放回磁力架中。

按照之前所述方法计数分离的细胞。将收集的细胞在300 × g离心5分钟。弃去上清液后，用含10% FBS的完全α最低必需培养基将细胞重悬至每毫升100万个细胞。

为了诱导破骨细胞分化，向细胞悬液中加入M-CSF，使其终浓度为25纳克/毫升，并通过移液充分混匀以使细胞悬液均匀。将100微升悬液每孔接种于平底96孔板中。随后，向培养板中每孔已接种细胞的周围加入200微升无菌蒸馏水，以防止培养体系中培养基蒸发及边缘效应。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，时间约为18至20小时。准备新鲜培养基，添加M-CSF和RANK配体。孵育结束后，使用P200移液器小心吸去一半培养基，更换为新鲜的、预热的完全培养基，其中补充M-CSF和RANK配体，终浓度为25纳克/毫升。

将细胞诱导分化为破骨细胞，持续七至十四天，每三天完全更换一次培养基。移除培养基后，每孔加入100 µL预先配制的固定液，对已分化的贴壁破骨细胞进行固定，孵育一分钟。操作时勿触碰孔底，以免刮伤贴壁细胞。

用300微升无菌蒸馏水将各孔洗涤三次后，轻拍平板使孔内液体去除，然后向每孔中加入100微升新鲜配制的染色液。将平板在37°C避光孵育20分钟。孵育结束后，通过倒置平板去除染色液，并用每孔300微升蒸馏水洗涤平板三次。

轻拍培养板至纸巾上以去除多余水分，将培养板敞开放置并避光，过夜空气干燥。使用具有拼图成像功能的明场显微镜，在10倍或20倍放大下拍摄整个孔表面的图像。利用配备细胞计数插件的图像分析软件，手动计数鉴定出的TRAP阳性紫色染色细胞（即含三个以上细胞核的破骨细胞）。

将分离得到的CD14+单核细胞以每孔100微升、细胞密度为每孔1×10⁵个细胞的量接种于18孔板中。在M-CSF和RANK配体存在条件下诱导破骨细胞分化，每三天完全更换一次培养基，具体操作如前所述。在实验终点时，轻轻吸去培养基，用200微升pH 7.4的预温PBS洗涤每孔两次。

各步骤之间切勿让孔板干燥。每孔加入100 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液固定样本，在室温下于摇床上轻轻振荡孵育10分钟。孵育结束后，用PBS每孔200 µL洗涤细胞两次。

用每孔100 µL的0.1% Triton X-100 PBS溶液对细胞进行透化处理，孵育10分钟，操作如前所示。用每孔200 µL的PBS洗涤两次。为阻断非特异性结合并增强信号，加入100 µL由2%牛血清白蛋白与PBS溶液配制的封闭液。

在室温下，于旋转摇床上轻轻振荡孵育20分钟。移除封闭液后，向每孔加入100 µL用2% BSA/PBS溶液稀释的荧光标记鬼笔环肽溶液。用PBS每孔200 µL洗涤两次。

使用含有300纳米DAPI的PBS溶液对细胞核进行染色，每孔加入100微升。染色10至15分钟后，吸除DAPI溶液，每孔加入100微升PBS替代。使用合适的免疫荧光显微镜或共聚焦显微镜，在4至40倍放大倍数下观察染色结果。

成熟的破骨细胞定义为 TRAP 阳性多核细胞。加入 RANK 配体后，TRAP 阳性多核破骨细胞的数量随剂量增加而增多。单核细胞向破骨细胞分化的动力学过程在 2 至 14 天的培养期内进行了研究。

从第5天开始可见多核破骨细胞，第7天时分化达到最佳状态。将破骨细胞分化至矿化表面，可通过分析圆形凹陷或吸收陷窝的形成来评估其吸收活性。与仅使用M-CSF相比，在M-CSF和RANK配体共同存在时，吸收百分比显著增加。

此外，与未处理的对照孔相比，鱼藤酮呈剂量依赖性地抑制了矿化表面的吸收。鱼藤酮依赖性的破骨细胞吸收抑制与ATP生成的抑制相关。在鱼藤酮存在下，可观察到由RANK配体诱导形成的成熟破骨细胞骨吸收陷窝（OCS）中肌动蛋白环的断裂。

必须确保富集的单核细胞中不含血小板，细胞接种密度适宜，并且周围孔中加水以避免边缘效应。该方案在基础和转化科学研究中，对于从机制上探究破骨细胞的形成过程及其功能调控因素特别有用。例如，可通过使用能够调节这些过程的化合物或蛋白质来进行研究。