构建无基因克隆的基因中断型Streptococcus mutans菌株

本实验的总体目标是利用两步融合 PCR 与电穿孔技术，构建靶向基因敲除的变异链球菌（Streptococcus mutans）菌株。该方法可用于解答微生物学领域中的关键问题，例如目标基因的功能机制。该技术的主要优势在于除 PCR 外无需其他酶促反应，且用于电穿孔的 competent 细胞制备过程十分简便。尽管该方法主要用于研究变异链球菌的基因敲除技术，但也可推广应用于其他微生物种类，例如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，原因在于他们对第二轮 PCR 中巢式引物（nested primers）的扩增效率不够熟悉。本实验操作将由本实验室的研究讲师 Ayako Okada 博士进行演示。开始实验前，将保存的 S. mutans UA159 菌种划线接种于脑心浸液（brain heart infusion，BHI）琼脂平板上，并在 37 摄氏度厌氧条件下培养过夜。次日，使用无菌牙签挑取单个菌落，接种至 5 毫升 BHI 液体培养基中，在 37 摄氏度厌氧条件下过夜培养。随后，以 2000 × g 离心 15 分钟收集菌体，弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于 5 毫升 PBS 中。再次以 2000 × g 离心 15 分钟，弃去上清液后将菌体沉淀重悬于 200 微升 PBS 中。使用基于珠击法的基因组 DNA 提取试剂盒从上述菌悬液中提取基因组 DNA。首先将菌悬液转移至含有玻璃珠的 2 毫升样品管中，然后向管中加入 750 微升裂解液。盖紧管盖，对称放置于珠击破碎仪的管架中，以最大速度处理 5 分钟。将珠击处理后的样品以 10,000 × g 离心 1 分钟，将上清液转移至置于 2 毫升收集管中的离心柱中，以 7000 × g 离心 1 分钟。向滤液中加入 1200 微升 DNA 结合缓冲液，混匀后取 800 微升混合液转移至置于 2 毫升收集管中的离心柱中，以 10,000 × g 离心 1 分钟。弃去穿流液，向离心柱中加入 200 微升预洗缓冲液以洗涤柱基质，以 10,000 × g 离心 1 分钟。再次弃去穿流液，加入 500 微升洗涤缓冲液洗涤柱基质，再次离心。将每个离心柱转移至新的 1.5 毫升微量离心管中，向柱基质中加入 100 微升洗脱缓冲液，以 10,000 × g 离心 30 秒以洗脱基因组 DNA。通过分光光度计测定 260 纳米和 280 纳米处的吸光度，评估 DNA 的浓度与纯度。第一轮 PCR 使用 S. mutans 野生型基因组和合成的链霉素抗性基因作为 PCR 模板。采用三组引物分别扩增糖基转移酶 C（glycosyltransferase C，gtfC）基因的上游侧翼区、gtfC 基因的下游侧翼区以及壮观霉素抗性基因。将每组 PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳分离。第一轮 PCR 所得各产物的大小应约为 1 KB。使用凝胶条带切割工具切下相应条带，并按照文本方案所述方法纯化各扩增的 DNA 产物。下一步是将这三个摩尔量大致相等的 DNA 片段作为 PCR 模板进行第二轮 PCR。利用合适的引物对这些片段进行扩增与拼接，以生成基因敲除构建体。由于本实验的成功依赖于第二轮 PCR 对敲除构建体的有效扩增，因此必须通过电泳确认第二轮 PCR 产物。取 1/10 的 PCR 反应混合物在 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳，以确认扩增产物具有预期的条带大小。在本示例中，巢式引物实现了更佳的扩增效果。将剩余的 PCR 混合物转移至新的 1.5 毫升微量离心管中，加入 55 微升超纯水，使总体积调整至 100 微升。加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2），随后加入 2.5 体积的 100% 乙醇，混匀。在 -80 摄氏度冷冻 30 分钟。在 4 摄氏度以 15,000 × g 离心 20 分钟。离心结束后，检查管底是否有沉淀。弃去上清液，用 1 毫升 70% 乙醇洗涤沉淀，在 4 摄氏度以 15,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀在空气中干燥约 30 分钟。最后，用 10 微升超纯水溶解沉淀。此前已制备并分装为 50 微升一份的 S. mutans UA159 感受态细胞，保存于 -80 摄氏度。将每份 50 微升的冰上预冷的感受态细胞与 5 微升的敲除构建体混合，加入电穿孔比色皿中（电极间距为 0.2 厘米）。使用电穿孔仪的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）模式进行电穿孔。电穿孔后立即用 500 微升 BHI 液体培养基重悬细胞，并将 50 微升菌液接种至含壮观霉素的 BHI 琼脂平板上。将平板在 37 摄氏度培养 2 至 6 天