模式蓝藻物种中标记和无标记突变体的构建

本实验的总体目标是展示一种在集胞藻属 PCC6803（Synechocystis species PCC6803）中产生无标记突变体，以及在聚球藻属 PCC7002（Synechococcus species PCC7002）中产生标记突变体的系统。该方法有助于回答蓝细菌遗传学领域的关键问题，例如如何将染色体修饰引入菌株中。

通过插入一个抗生素抗性基因，随后利用负筛选标记将该盒式结构移除。该技术的主要优势在于可对菌株进行反复的遗传操作，从而能够根据需要向菌株中引入任意数量的修饰。

根据文本方案，在制备好培养基、蓝细菌菌株和质粒后，取一环蓝细菌细胞接种于30至50毫升BG11培养基中，建立新鲜培养物。将培养物置于30摄氏度光照条件下培养2至3天，使其OD750达到0.2至0.6。

孵育结束后，取1至2毫升培养物，在2,300×g下离心5分钟。弃去上清液后，用BG11培养基洗涤沉淀一次，轻轻吹打重悬细胞。注意避免使用涡旋振荡，因为涡旋可能导致对DNA摄取至关重要的菌毛丢失。

再次离心收集细胞并去除上清液后，加入 BG11 培养基至终体积 100 微升，并将细胞转移至 14 毫升圆底管中。接着，向细胞中加入 1 微克先前制备的质粒 A，轻轻敲击混匀。

然后将试管水平放置于30摄氏度的培养箱中，培养4至6小时。培养结束后，将细胞培养物质粒DNA混合液的等分试样涂布于不含抗生素的BG11琼脂平板上，并在30摄氏度下培养。

约24小时后，用含有卡那霉素的水配制0.6%的琼脂溶液，并使其冷却至42摄氏度。然后将2.5至3毫升该溶液加入培养皿的边缘，并倾斜培养皿，使溶液在表面形成一层均匀的顶层琼脂层。

将平板培养约七天，直至菌落可见。然后将一块新的添加了卡那霉素的 BG11 琼脂平板分为六个区域，用钝头牙签挑取单菌落进行划线分离。

为了进行PCR以确认显著的基因敲除，将少量细胞转移至含有50 µL水和约20个直径为425至600 µm玻璃珠的离心管中。在约2,000 rpm条件下振荡细胞与玻璃珠5分钟，随后在15,700 ×g下离心5分钟。然后取5 µL上清液用于制备50 µL的PCR反应体系，使用tack DNA引物。

为了验证突变体，在根据文本方案设计引物后，使用以下程序扩增产物，并设置野生型对照。通过凝胶电泳验证敲除转化子的基因型，应显示出一条约四千碱基对的条带，且无野生型条带。

更多细节请参见文字版实验方案。如果仍然存在野生型条带，则需将菌株重新划线接种至新鲜培养板上，并重复PCR检测。重复验证过程，直至突变体完全分离，且PCR反应中不再观察到野生型条带。

对于表现出明显突变特征的菌株，需在新鲜平板上重新划线，用于构建无标记敲除突变体。为构建无标记的集胞藻（Synechocystis）突变体，取含有标记的敲除菌株，用接种环挑取大量细胞接种于30至50毫升BG11培养基中，制备新鲜培养物。将培养物培养两至三天，使其OD750达到0.2至0.6。

将10毫升培养物在2,300 ×g下离心5分钟，弃去上清液。然后用BG11培养基轻轻洗涤细胞。加入BG11培养基至终体积为200微升，将细胞转移至14毫升圆底管中，向细胞中加入1微克质粒B DNA，轻轻敲击混匀。

然后将试管水平放置于培养箱中，孵育4至6小时。孵育结束后，加入1.8毫升BG11培养基，并将样品在振荡条件下继续孵育，总时间为4天。这段时间足以使多个染色体拷贝之间发生重组。

将转化后的培养物分别取 50、10 和 1 微升点种于添加 5% 蔗糖的 BG11 琼脂平板上，培养约七天以获得单菌落。随后，使用钝头牙签从平板上挑取 30 至 50 个单菌落，转接至含卡那霉素的 BG11 平板进行划线培养。然后将其影印至添加 5% 蔗糖的 BG11 平板上。

在 BG11 加蔗糖培养基上生长但在含卡那霉素的平板上不生长的菌落，可能是无标记敲除子。在两种平板上均能生长的菌落，可能由于 sacB 基因发生突变而具有蔗糖抗性。采用本视频前面展示的 PCR 方法验证无标记敲除子，其扩增产物在凝胶电泳中应显示一条对应于野生型大小减去缺失区域的条带。

如果菌株表现出无标记突变特征，则将其重新划线接种于不含抗生素的新鲜BG11琼脂平板上。为长期保存菌株，取该菌株的单菌落接种于30至50毫升BG11培养基中，制备新鲜培养物。将培养物培养三至四天，直至其OD750达到0.4至0.7。

使用 BG11 洗涤细胞一次后，将沉淀重悬于约两毫升 BG11 中。取 0.8 毫升浓缩细胞加入一个离心管中，然后加入 0.2 毫升 80% 经滤膜除菌的甘油。

向另一管中加入 0.93 毫升浓缩细胞和 0.07 毫升 DMSO。将两管均于 -80 °C 保存。复苏菌株时，取出冻存管，用钝头牙签刮取少量细胞接种至不含抗生素的琼脂平板上。

然后使用无菌接种环按常规方法进行划线分离。该图展示了用于构建缺失突变体的质粒A和质粒B的示例。在每种情况下，5′端和3′端的侧翼区域长度均约为900至1,000个碱基对。

质粒B在5'端和3'端约一千个碱基对的侧翼区域之间，也可包含一个基因盒，或天然基因序列的修饰版本。用质粒A转化后，平板上将在7至10天后出现数百个菌落。

如果基因为非必需基因，且突变体表现出与野生型菌株相似的生长状态，则通过PCR检测应发现所有染色体均含有插入的 npt1/sacB 序列拷贝。如果基因为非必需基因，但突变体生长缓慢，则需要进行多轮随着卡那霉素浓度递增的重新划线培养，以获得已分离的标记突变体。若经过反复划线培养后仍无法获得标记突变体，则该基因很可能为生存所必需。

通过质粒B转化获得的大多数单菌落将对卡那霉素敏感且对蔗糖具有抗性。如本实验所示，对这些菌落中靶区域进行PCR扩增的结果表明，几乎100%的菌落具有无标记突变特征。一旦掌握该技术，若操作得当，可在六周时间内于数小时内完成整个流程。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记使用无菌技术。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如测量氧气产生量或气相色谱-质谱联用分析，以回答更多科学问题，例如测定光合作用速率或代谢物的生成。该技术建立后，为蓝细菌遗传学领域的研究人员开辟了新的研究途径。

为了研究该门类中的关键生物化学和生理过程，并开发用于工业目的的菌株。观看本视频后，您应能够充分理解如何在集胞藻 PCC6803 中生成无标记的基因敲除突变体。