一种经济高效且可灵活调整的划痕迁移实验方法

本方案为一种传统技术提供了新的方法，将为大量基础科学研究人员提供一种全新的研究途径。该技术的主要优势在于其成本效益高，且具有良好的适应性，可供更广泛的科学工作者使用。制备迁移板时，使用浅色的永久性记号笔在48孔板每个孔的背面中央画一条直线，并绘制三条刻度线，将每个孔均分为三个独立的观察区域。

然后将1.5×10⁴至2×10⁴个单次传代的心脏成纤维细胞接种到每个孔中，在正常培养条件下培养24至48小时，直至细胞融合度达到90%至95%。当细胞准备就绪后，吸去每孔中的上清液，使用无菌的P200移液器枪头沿预先画好的线轻轻划一道划痕。用低血清培养基冲洗各孔，以去除未贴壁的心脏成纤维细胞，随后向每孔中加入500 µL低血清培养基。

若使用药理学试剂，需将试剂加入相应的孔中。随后，使用倒置显微镜配合20倍物镜，利用孔板上的标记定位每孔，拍摄两张零小时图像，确保划痕线的上半部分位于视野中。然后移动孔板，使划痕线的下半部分进入视野，采集第二张图像，最后将孔板放入细胞培养孵育箱中培养24小时。

孵育结束后，在通风橱中用非无菌的PVS洗涤每个孔，并向每个孔中加入500 µL的4%多聚甲醛。室温下放置10分钟后，用新鲜的PBS洗涤每个孔三次，每次洗涤5分钟。最后一次洗涤后，每孔加入300 µL通透液，在室温下轻轻摇动30分钟以通透细胞。

孵育结束后，将通透溶液替换为1% Kumasi亮蓝染色液，在室温下轻轻摇动染色10分钟。随后用PBS轻轻摇动洗涤三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，向每个孔中加入300微升PBS，并小心地将培养板放置在与零小时图像相同的位置，然后按示例所示，对每个孔采集两张24小时的图像。

实验结束时，打开图像并启动合适的图像分析软件，在零小时图像上创建一个新图层。双击以更改新图层的名称为“划痕图层”，然后选择画笔工具。将画笔像素大小设置为10，颜色设置为红色，绘制两条相互分离的直线以标记划痕的轮廓。

划线不应接触任何细胞。在成像软件中打开24小时的图像，并选择移动工具。按住控制按钮，同时点击线条和背景图层，在0小时图像的中心位置点击，然后将这两个图层拖动到24小时图像的中央。

在24小时图像中，单击0小时背景图层，并将不透明度更改为50%。按住控制键，同时选中0小时背景图层和线条图层，然后点击编辑并选择自由变换，以对图层进行自由变换。通过自由变换，将0小时的背景图和线条图与24小时的背景图像对齐，使区域迁移线在24小时图像中正确定位。当线条图层成功叠加后，右键单击以删除0小时背景图层。剩余的线条图层可用于确定在24小时内迁移至划痕区域的细胞数量。

然后将新的迁移图像同时保存为 Photoshop 格式以及 TIFF 或 JPEG 文件。为了定量分析迁移细胞的数量，打开迁移图像和一个可读取 TIFF 或 JPEG 文件的程序，手动计数每孔两幅图像中位于两条红线之间并接触红线的细胞数量。然后记录每幅图像中迁移细胞的数量。

为确定迁移面积，打开含有24小时划痕迁移线的图像，将其在成像软件中保存为迁移面积图像。保存后，点击背景图层，右键单击以删除该图层。使用画笔工具，以绘制划痕线时相同的颜色填充划痕线之间的区域，然后点击图像、模式、灰度，将图像转换为黑白图像。

保存图像，打开迁移区域图像，并启动合适的图像分析软件程序。点击“编辑”，然后选择“反相”。为确定迁移线的面积，点击“图像”→“调整”→“阈值”。

黑色迁移区域将变为红色，阈值框中将显示迁移面积百分比。记录该迁移条带的面积百分比，并确认该数值与同一图像中迁移细胞的数量相对应。在此分析中，在24小时的实验时间内，来自非糖尿病心脏的46个成纤维细胞和来自糖尿病心脏的129个成纤维细胞发生了迁移。

如图所示，迁移面积的测量结果显示，非糖尿病组划痕区域占所测总面积的24.78%，而糖尿病组迁移划痕区域占所测总面积的16.77%。通过归一化迁移面积可更准确、更严格地评估细胞迁移能力，并消除潜在的人为误差。例如，若仅比较迁移成纤维细胞的数量，则在此分析中可能显示该孔中迁移的细胞数量是第二孔中迁移细胞数量的两倍。

然而，当使用划痕面积对数据进行归一化时，观察到两个孔中成纤维细胞与迁移面积的比值几乎相同。请务必在24小时的图像中重新捕获与零小时图像中相同的迁移区域面积。按照此步骤操作后，可进行免疫组织化学染色，以检测细胞内蛋白质的表达情况。

我们认为，这种划痕迁移实验的新方法将为此前无法开展的更多科学研究方向开辟新的途径。