用于细胞应用的核壳结构掺杂镧系上转换纳米晶的合成

本实验的总体目标是通过高温共沉淀法合成核壳结构的掺杂镧系元素上转换纳米晶体，并进行生物相容性表面修饰，以实现其在细胞层面的进一步应用。在过去几年中，本实验室开发出一种极为独特的掺杂镧系元素上转换纳米晶体，该材料展现出极为特殊的光学性质，能够吸收长波长的红外光，并将其高效转化为短波长范围内的多色发射光，包括紫外光、可见光，甚至特定窗口的红外光。此类独特的纳米晶体结构在生物医学应用中展现出极具前景的性能。

该方法为合成核壳结构上转换纳米材料及其生物相容性表面修饰技术提供了一种可行的方案，可用于在近红外光照射下调控光控膜通道蛋白。开始实验前，需在甲醇中配制稀土乙酸盐配合物的储备液，并分别配制浓度为20毫克/毫升的氢氧化钠和氟化铵甲醇溶液。

将储备溶液储存于 4 摄氏度。然后，用移液器将 3 毫升油酸和 7 毫升 1-十八烯转移至一个 50 毫升三颈圆底烧瓶中。向其中加入 1.089 毫升乙酸钇溶液、0.608 毫升乙酸镱溶液、83.6 微升乙酸铥溶液和 128.5 微升乙酸钕溶液。

在烧瓶中放入搅拌子和温度计。将烧瓶置于油浴中，加热至100摄氏度，同时搅拌，直至甲醇完全蒸发。然后将烧瓶连接至施伦克线，抽真空两到三分钟，以除去残留的甲醇。

接下来，将烧瓶置于氮气氛围下。在700 rpm搅拌条件下，将反应混合物于150摄氏度加热一小时。然后，让混合物冷却至室温。

接下来，将2毫升氢氧化钠储备溶液和2.965毫升氟化铵储备溶液加入一个15毫升离心管中。盖紧管盖，涡旋震荡氢氧化钠与氟化铵混合液5秒。在5分钟内，使用玻璃移液管将氢氧化钠-氟化铵混合液缓慢加入反应烧瓶中，同时持续搅拌。

然后，将反应混合物加热至不超过 50 摄氏度。在该温度下保持 30 分钟。随后，将混合物加热至 100 摄氏度以蒸发甲醇。

将烧瓶连接至施伦克线，在真空下除去残留的甲醇，持续两到三分钟。用氮气充满烧瓶，然后以每分钟5摄氏度的速率将反应混合物加热至290摄氏度。在290摄氏度或略高于290摄氏度的条件下保持反应混合物1.5小时。

然后，在搅拌下使混合物冷却至室温。将产物混合物转移至50毫升离心管中。用30毫升乙醇将残留物冲洗入该离心管中。

在室温下以 4,000 × g 离心混合物 8 分钟。弃去上清液，并通过超声处理 2 分钟将固体分散于 10 毫升正己烷中。向该分散液中加入 30 毫升乙醇，再次在相同条件下离心混合物，然后弃去上清液。

将固体分散于5 mL正己烷中，并在4°C下保存分散液。在暗处用808 nm激光照射，检测核-壳上转换纳米粒子（UCNs）溶液的上转换发光。开始制备DBCO修饰的UCNs时，将已制备的核-壳纳米晶体在30 mL乙醇中通过离心洗涤。

弃去上清液，加入10毫升pH为4的盐酸水溶液。超声处理混合物30分钟以溶解固体。将混合物转移至玻璃小瓶中，剧烈搅拌2小时。

然后，用四份30毫升的乙醚洗涤混合物。合并乙醚相，并将洗涤后的水相保留备用。用10毫升去离子水从乙醚相中回收痕量无配体的上转换纳米颗粒，并合并水相。

向合并的水相中加入 20 毫升丙酮，涡旋混合 5 秒。在 35,000 ×g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀溶于 2 毫升去离子水中，得到无配体的上转换纳米颗粒溶液。

接下来，将200毫克聚丙烯酸溶于20毫升去离子水中，超声处理20分钟。在剧烈搅拌下，将无配体的上转换纳米颗粒（UCNs）溶液加入其中。用1摩尔的氢氧化钠溶液调节混合物的pH至7.4。

将混合物超声处理30分钟，然后在室温下搅拌24小时。接着在35,000 ×g条件下离心10分钟。用10毫升去离子水通过离心洗涤沉淀物四次。

将洗涤后的固体分散于8 mL去离子水中，得到浓度为10 mg/mL的聚合物修饰UCNs溶液。取1 mg聚合物修饰的UCNs在35,000 ×g下离心10分钟。将剩余溶液于4 °C保存。

将固体用1毫升干燥DMF分三次离心洗涤。然后将沉淀物溶解于200微升干燥DMF中。向该溶液中加入12.2毫克HOBT、14毫克EDC、5毫克DBCO-胺和16微升DIPEA。

在室温下搅拌混合物24小时。然后，在35,000 × g条件下离心混合物10分钟。用一毫升等份的DMSO通过离心洗涤固体四次。

将DBCO修饰的UCN分散于0.2毫升DMSO中，并将分散液在4摄氏度保存。首先，在12孔板中接种1×10⁵个HEK293细胞，并在37摄氏度下培养细胞24小时。然后，在微量离心管中，将1微克选定质粒与2微升P3000转染试剂加入100微升MEM中混合。

在另一个微量离心管中，将 1.5 µL 转染试剂与 100 µL MEM 混合。将两种混合物在室温下孵育 10 分钟。然后将混合物合并，并加入 400 µL 低血清 MEM。

接下来，用不含血清的DMEM以每次1毫升的量洗涤孵育后的细胞两次。将600微升转染混合物分配至12孔板的各孔中。在37摄氏度下孵育细胞4小时。

然后，移除培养基，用1 mL的DMEM溶液将细胞洗涤两次。在各孔中加入1 mL用DMEM配制的四乙酰化N-叠氮乙酰基甘露糖胺溶液。将细胞在37°C下孵育两天。

然后，将细胞洗涤、胰酶消化，并在共聚焦培养皿中重新接种，过夜培养。接着，更换培养基为1毫升含有2微升50毫克/毫升DBCO-UCNs溶液的新鲜DMEM。在37摄氏度孵育2小时，用DMEM洗涤细胞两次。

关闭通风橱的照明，向细胞中加入适量的二烯缓冲液用于钙离子成像，并在避光条件下孵育30分钟。用无血清DMEM洗涤细胞。使用波长为808纳米、功率密度为0.8瓦特每平方厘米的近红外光照射细胞。

交替进行5分钟照射与5分钟间歇，直至细胞累计照射时间为20分钟。使用共聚焦显微镜对细胞成像。核心及核壳结构上转换纳米颗粒的透射电子显微镜结果显示，其呈球形结构，壳层厚度约为5纳米。

高分辨率透射电子显微镜显示晶面间距与高度结晶的纳米结构一致。经过表面修饰后，上转换纳米颗粒可轻松分散于缓冲溶液中。动态光散射结果显示，DBCO-修饰的上转换纳米颗粒在水溶液中的流体力学直径约为96纳米。

聚丙烯酸（PAA）和DBCO修饰的上转换纳米颗粒（UCNs）的Zeta电位表明其表面带负电荷，这与它们在水相缓冲溶液中的溶解性和稳定性一致。上转换发光测试显示，当使用808纳米光照射时，PAA和DBCO修饰的UCNs与基础核壳结构UCNs具有相同的发射模式。采用表达光控通道蛋白的叠氮标记HEK293细胞来测试DBCO-UCNs的生物应用性能。

UCN 在叠氮标记处的定位归因于 DBCO 基团被含叠氮的染料标记。当这些细胞暴露于近红外光时，DBCO-UCN 促进了钙离子跨细胞膜的流动，共聚焦成像和流式细胞术结合荧光钙离子指示剂的结果证实了这一点。观看本视频后，您应充分了解如何按照本方案制备具有生物相容性表面修饰的核壳结构上转换纳米晶体，并进一步将其应用于活细胞中光控离子通道的激活。