高速超分辨率SPEED显微镜在活体初级纤毛中的应用

本实验的总体目标是确定初级纤毛中的蛋白质运输途径。该方法有助于解答纤毛研究领域的一些关键问题，例如正常纤毛与功能障碍纤毛中蛋白质运输途径的差异。该技术的主要优势在于其分辨率足够高，能够在活细胞中观察到亚衍射极限的蛋白质运输路径。

首先，在实验开始前一个半周，将经过特殊基因工程改造的 NIH-3T3 细胞冻存液在 37 摄氏度下解冻。将解冻后的细胞转移至含有 3 毫升预热培养基的 25 平方厘米细胞培养瓶中。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中进行培养。

将细胞培养至融合度达到80%后进行传代。传代时，用0.25%胰蛋白酶在37摄氏度下消化细胞2分钟。短暂孵育后，吸除胰蛋白酶溶液，并加入2毫升预热的培养基。

用移液器吹打培养基以分散细胞团块，然后从培养瓶中移除75%的细胞，并将培养基总体积补至三毫升。实验前至少传代三次，以确保细胞周期的均一性。实验前两天进行细胞传代，将细胞以60–70%的融合度接种于含1.5毫升相同培养基的35毫米玻璃底培养皿中。

然后，在实验前一天，使用目标质粒对细胞进行化学转染。将500–1000纳克质粒与转染试剂按1:2.5的比例混合，并加入0.25毫升不含抗生素的低血清培养基，室温孵育30分钟。转染复合物形成后，吸去35毫米玻璃底培养皿中的培养基，替换为0.25毫升转染混合物及额外添加的1.25毫升不含抗生素的低血清培养基，然后将培养皿放回培养箱中继续培养。

对于表面标记SSTR3构建体的细胞，在实验前一小时从玻璃底培养皿中移除培养基。用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞五次，并加入一毫升含有一微摩尔Alexa 647标记链霉亲和素的低血清培养基。在实验开始前不超过15分钟，从玻璃底培养皿中移除培养基，并用一毫升PBS洗涤细胞五次。

然后向玻璃底培养皿中加入一毫升成像缓冲液。将玻璃底培养皿固定在显微镜载物台上。使用GFP滤光片组找到表达GFP的细胞，并定位一根初级纤毛中正确表达SSTR3-GFP的细胞。

找到合适的细胞后，将初级纤毛基部的 NPHP4-mCherry 斑点与成像平面上对应激光单点照射的位置对齐。在聚焦控制窗口的相机选项卡中使用拍摄功能，获取 NPHP4-mCherry 和绿色荧光蛋白标记的 SSTR3 蛋白的落射荧光图像。获得参考图像后，使用1毫瓦的激光照射过渡区20秒，以局部降低标记单分子的浓度。

为进行单分子示踪实验，将标记有 Alexa 647 的分子的激光照射功率降低至 0.5 毫瓦。将增益和增益强度设为最大值，帧速率为 2 毫秒。然后点击聚焦控制窗口中相机选项卡的“流”按钮，并启动相应的激发激光。

记录非光漂白的标记单分子在通过过渡区光漂白区域时的运动情况。注意录像时间不超过两分钟，以避免纤毛漂移的影响。捕获单分子后，使用二维高斯拟合算法（如Gelles实验室开发的Glimpse）对视频进行处理，精确定位每个单分子激发点的质心、点扩散函数及其周围感兴趣区域。

最后，选择所有定位精度优于10纳米的单分子位置，并基于用二维高斯函数拟合的单分子位置分布来校正纤毛的中心。如本视频所述，可利用单点照明追踪被AF647标记的SSTR3分子穿过由NPHP4-mCherry标记的过渡区的过程。在数据分析之前，将单分子视频叠加到宽场照明图像上是一个有用的验证步骤，以确保激光正确对准，并且具有足够的信噪比。

图中所示为一个通过染色鉴定出具有初级纤毛的细胞。IFT20 是鞭毛内转运复合体的一个组分，可沿初级纤毛内部的微管运输货物，初级纤毛由 Arl13b-mCherry 标记。鉴定后，采用高速显微镜追踪单个 IFT20-GFP 蛋白的运动。

接下来，使用二维到三维转换算法，沿单一维度生成蛋白质在初级纤毛内部的空间概率密度分布。该高密度区域很可能与轴丝微管共定位，这与已知的纤毛内运输路径位置一致。在进行此操作时，重要的是要将样品与激光精确对齐，以尽量减少系统误差。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用高速显微镜进行单分子示踪，并掌握获取初级纤毛中单分子运输路径的方法。