单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smFISH）分析

本优化的单分子RNA原位杂交（smFISH）技术的总体目标是在芽殖酵母营养生长和减数分裂过程中，对单个细胞中的RNA分子进行检测和定量。该方法能够揭示基因表达在细胞间的异质性以及RNA在亚细胞水平的定位情况，因此是研究基因调控的一种强大技术。除了smFISH所能提供的独特信息外，该技术的主要优势在于，一旦完成优化，其实验结果稳定且高度可重复。

本方案将以减数分裂培养物进行演示。将1840微升培养物加入含有160微升37%甲醛的2毫升微量离心管中，使终浓度为3%甲醛，用于固定培养物。颠倒混匀约5次。

将离心管置于室温下的旋转滚筒上，孵育20分钟。20分钟后，于4摄氏度旋转条件下继续固定过夜。次日，开始消化前，先在65摄氏度下解冻200毫摩尔的钒酸核糖核苷复合物（VRC）至少10分钟。

配制消化主混合液时，首先将2125微升缓冲液B移液至15毫升离心管中。然后将温热的VRC涡旋振荡5秒以充分重悬，并将200微升VRC加入15毫升离心管中。混合液应呈现浅棕绿色。

将减数分裂样品在室温下以 21,000 × g 离心 1.5 分钟。小心吸除上清液，将真空吸头置于沉淀的对侧，避免扰动沉淀。用移液器反复吹打，将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。

在 21,000 × g 条件下离心 1.5 分钟。用真空抽吸法除去大部分液体，留下约 100 微升。将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。离心样品，弃去上清液，再次将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。

在21,000 × g下离心1.5分钟。用移液器完全吸除上清液。将细胞重悬于425 µL消化主混合液中，并短暂涡旋振荡。

向离心管中加入 5 µL 溶壁酶，涡旋 2 至 3 秒以混匀。将离心管置于滚轴混合仪上，在 30 °C 条件下消化 15 至 30 分钟。消化 15 分钟后，每隔 5 分钟在显微镜下观察细胞，当约 80% 的细胞呈现不透明且无折射性时，停止消化。

将离心管在376 × g下离心3分钟。完全去除上清液。用1毫升缓冲液B轻轻重悬细胞，上下吹打1至2次以混匀。

将离心管离心并弃去上清液。在1毫升70%乙醇中轻柔重悬细胞，并在室温下孵育3.5至4小时。开始杂交步骤时，在376 × g下离心细胞悬液3分钟。

从离心管中移除 500 微升 70% 乙醇。轻轻吹打重悬剩余细胞，并将细胞转移至低吸附离心管中。将样品转移至低吸附离心管对于防止后续甲酰胺洗涤过程中细胞过度丢失至关重要。

将低吸附离心管离心并彻底去除乙醇。向管中加入1毫升10%甲酰胺洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀2至3次以重悬细胞。在按照文本方案准备杂交溶液的同时，将细胞于室温下静置约20分钟。

将样品离心，并将上清液移至有害废物容器中。向管中加入至少50微升的每种杂交溶液，轻弹管壁混匀。在30摄氏度下于滚轴混合仪上避光孵育至少16小时。

杂交完成后，将细胞管放入用铝箔包裹的盒子中以避光。在376 × g下离心3分钟。用移液器将上清液移至有害废物容器中。

用1 mL 10%甲酰胺洗涤缓冲液重悬样品，轻轻吹打混匀2至3次。将细胞管放回用铝箔包裹的盒子中以避光，并在30°C下孵育30分钟。孵育结束后，离心样品。

用移液器将上清液移除至有害废物容器中，残留约50微升。用1毫升DAPI溶液重悬样品，轻轻吹打2到3次。再次将细胞管放入锡箔包裹的盒子中，在30摄氏度下孵育30分钟。

将样品离心，并用移液枪彻底去除上清液。对于不立即成像的样品，将沉淀重悬于50 µL不含酶的GLOX缓冲液中。上下吹打三至四次以混匀。

避光置于4°C的盒子中，直至准备成像。对于需立即成像的样品，加入15至20微升含酶的GLOX缓冲液。用移液器吸取5微升滴加到盖玻片上，然后将盖玻片放置在载玻片上。

在盖玻片放置位置的载玻片上方铺一张实验室擦拭纸。轻轻按压擦拭纸，以固定载玻片。将载玻片放入用铝箔包裹的盒子中，转移至显微镜室。

本方案用于检测 NDC80 基因的表达，该基因表达两种 mRNA 亚型。长的未翻译转录本亚型相较于短亚型具有 400 个碱基对的 5' 端延伸序列。为此设计了两组探针。

CF 590 探针组结合于长亚型独特的 5' 区域，而 Q 670 探针组结合于两种亚型的共有区域。在优化条件下，两种探针组均能清晰识别出明显的单分子FISH信号点。利用这两组探针研究了 NDC80 在营养生长和减数分裂过程中的表达情况。

在营养细胞中，可检测到Q 670探针组的强信号，但无法检测到CF 590探针组的信号。相反，在减数分裂前期，两种探针组均检测到强信号，且大多数信号点表现为共定位。Northern印迹分析证实，长亚型特异性地在减数分裂中表达。

发现营养细胞每细胞的短亚型转录本中位数为五个，而在减数分裂前期细胞中，每细胞转录本中位数显著下降至四个。在减数分裂前期，每细胞长亚型转录本的中位数为21，且100%的细胞均表达该转录本。一旦掌握，若操作得当，该技术可在72小时内完成。

在进行该实验操作时，首先需要优化消化时间以及实现最佳信噪比所需的smFISH探针浓度。此外，务必在消化及过夜杂交过程中加入VRC，以防止核酸酶活性。该技术的发展为研究人员探索动态基因调控和亚细胞水平的RNA定位奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何在酿酒酵母减数分裂过程中进行单分子RNA FISH实验。