检测暴露于有机氯农药的肝细胞中线粒体功能的实验方案

这是一种能够回答您在特定领域中关键问题的检测方法，例如 ATP 水平和氧气消耗速率。这种新技术或已有一页历史的旧技术的优势在于操作简便，且适用于对细胞线粒体功能进行深入评估。开始本实验时，在玻璃底培养皿中接种 20,000 个 HepG2 细胞。

将β-六氯环己烷（B-HCH）加入培养箱中，在37摄氏度及5% CO2条件下孵育24小时。通过将无水DMSO加入DMEM细胞培养基中，配制1毫摩尔的线粒体绿色荧光探针溶液。然后每皿加入1毫升该溶液至玻璃底培养皿中的细胞内。

在37摄氏度下孵育45分钟。孵育结束后，从细胞中移除线粒体绿色荧光探针溶液。每皿加入1毫升在37摄氏度下新鲜配制的DMEM细胞培养基。

为了检测线粒体中的绿色荧光，需在共聚焦显微镜下观察细胞。为评估细胞内ATP水平，将20,000个HepG2细胞接种至6孔板中。加入β-HCH，并在37°C下孵育24小时。

向每个孔中的细胞加入 200 微升裂解缓冲液。在 4 摄氏度下以 12,000 ×g 离心 5 分钟，并按照文本方案所述收集上清液。向孔板中加入 100 微升 ATP 检测缓冲液。

在室温下，将100微升收集的细胞上清液加入96孔板中，并按照文本方案所述，使用化学发光仪检测细胞内ATP水平。为评估线粒体膜电位，按照前述方法，在六孔板中培养HepG2细胞并加入β-HCH。用0.5毫升0.25% EDTA在37摄氏度消化细胞1分钟，收集细胞。

加入1毫升DMEM以终止消化，并将消化后的细胞转移至1.5毫升离心管中。以1000 ×g离心3分钟，然后弃去上清液。用0.5毫升细胞培养基和0.5毫升JC1线粒体膜电位染料重悬细胞沉淀。

在37摄氏度下孵育20分钟。接下来，在4摄氏度下以600 × g离心3分钟，然后根据文本方案洗涤细胞沉淀。离心洗涤后的沉淀后，弃去上清液。

将沉淀重悬于0.5毫升JC1染色缓冲液中。通过流式细胞术分析JC1染色的细胞，以检测绿色和红色荧光。当检测JC1单体时，激发光设为490纳米，发射光设为530纳米。

检测JC1聚合物时，将激发光设置为525纳米，发射光设置为590纳米。为分析耗氧率，将HepG2细胞以每孔100微升含4,500个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中。在37摄氏度孵育24小时后，确保每孔中的细胞均被培养基覆盖。

在运行OCR软件之前，按照文本方案中的描述，将装有试剂盒的微孔板和细胞培养板放入细胞外通量分析仪中。打开OCR软件，在应用程序下拉菜单中选择细胞线粒体应激测试试剂盒，然后点击启动应用程序按钮。接着，点击运行应激测试按钮。

当细胞应激测试界面出现时，在细胞接种数量框中输入每孔接种的细胞数，在基础OCR平均值框中输入平均OCR值。输入每种试剂的最终工作浓度，然后注入试剂。单击下一步按钮。

当出现组信息界面时，通过选择一种颜色并命名来为未分配的孔指定一个组。然后单击相应的孔。单击下一步按钮，在出现的应激测试加样布局界面中，单击“开始”以在分析仪上运行应激测试。

运行结束后，按照软件中的提示操作，然后取出并丢弃试剂盒和细胞板。暴露于β-HCH的HepG2细胞中，线粒体绿色荧光染色的平均强度降低。这表明随着农药浓度的增加，线粒体数量减少，受损线粒体增多。

此外，随着β-HCH暴露浓度的增加，HepG2细胞内的ATP水平下降，表明这些细胞中线粒体功能降低。经JC1染色检测线粒体膜电位（MMP）后，流式细胞仪显示完整HepG2细胞中JC1红色荧光较强，绿色荧光较弱。这是由于存在呈红色荧光的JC1聚集体，其为高MMP的标志。

经β-HCH处理的细胞中，由于绿色荧光JC1单体的存在，JC1的红绿荧光减弱，表明线粒体膜电位（MMP）降低。最后，随着β-HCH暴露浓度的增加，细胞的耗氧率也下降，进一步表明该农药会损害线粒体的正常功能。哦，对了，尽管尝试此实验步骤时，重要的是要记住选择适当的细胞来进行检测。

在该技术发展之后，无疑为探索与之相关的生物在医学作用中的基础功能研究领域开辟了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何在溢流板功能下检测某一数量或质量、能力、现有成员或潜力。