离体实体瘤匀浆线粒体功能的分析测定

本方案描述了一种简单且快速的肿瘤线粒体功能检测方法。该方案广泛适用于临床转化肿瘤学研究，有助于增强对线粒体在癌症发生和发展过程中作用的诊断性与机制性理解。该技术的主要优势在于采用组织匀浆法，简化了样品制备过程，最大化线粒体得率，同时减轻了扩散限制带来的影响。

该技术在临床和诊断领域具有潜在应用价值，可利用新鲜活检或切除的肿瘤组织对肿瘤线粒体功能进行定量评估。首先，将含有1毫升线粒体呼吸介质（MiR05）的玻璃匀浆器连同紧密配合的玻璃研杵置于湿冰上。将组织置于冰冻的培养皿中，加入1毫升活检组织保存液（BIOPS）。

将肿瘤切成每块约5至10毫克的小片，将剩余的肿瘤组织放回盛有10毫升冰上保存的BIOPS溶液的容器中。用滤纸小心吸干组织切片后，将其置于已去皮重的小型塑料称量舟中，记录初始湿重。将未使用的组织块放回10毫升锥形管中的BIOPS溶液中，以继续保存。

将组织切片浸入含有 MiR05 的冰浴匀浆器中，并记录称量舟中剩余的重量。使用间隙范围为 0.09 至 0.16 毫米的玻璃研杵，通过完成五到七次上下移动轻柔地破碎肿瘤组织。每次移动时，在向下推动研杵的过程中顺时针/逆时针旋转三次，向上拉回研杵时再额外旋转三次。

在研磨间隙让组织沉降到匀浆器底部，但避免将研杵完全提离液面，以防产生泡沫。将匀浆液倒入一个15毫升的锥形管中，并置于冰上。用移液器吸取1至3毫升新鲜的MiR05溶液，加在研杵上方并注入匀浆器中，以冲洗残留的组织匀浆。

将MiR05洗涤液倒入含有匀浆液的锥形管中。重复此步骤两到三次，以确保匀浆液完全转移。为了准确计算组织匀浆液的浓度，需仔细检查匀浆器和匀浆液中是否残留未匀浆完全的物质，包括结缔组织。

为了去除匀浆器中无法用镊子触及的未匀浆组织，在向匀浆器中加入MiR05后，用移液器吸取包括组织在内的液体，并将内容物转移至培养皿中。用移液器吸取匀浆液中沉降至锥形管底部的大块未匀浆组织，并将其置于锥形管盖上。用镊子从培养皿或锥形管盖上取下组织，并在滤纸上轻轻吸干。

将锥形管管帽中残留的匀浆液加回锥形管中。盖紧管盖，倒置混匀。重新检查匀浆器和匀浆液中是否存在未匀浆完全的组织，如有需要，重复上述步骤以去除未匀浆完全的物质。

称量并记录从匀浆器中回收的未匀浆组织的质量。检查匀浆液制备物中是否存在明显完整转移的组织，必要时移除未匀浆的组织块并进行称量。从初始湿重 中减去从称量舟、匀浆器及匀浆液中回收的组织重量，以计算最终样品重量。

根据最终样品重量，加入额外的MiR05缓冲液，使匀浆达到所需浓度。样品称重并制备完成后，应尽快进行检测。在转移至仪器前，始终将样品置于湿冰上保存。

仪器校准完毕且样品制备完成后，以旋转方式取下塞子，从腔室中吸出MiR05，注意避免接触腔室内暴露的膜。充分混匀匀浆液，然后向腔室中加入2.25毫升匀浆液。若将同一份匀浆液加入多个腔室，应每次向各腔室中移取1毫升匀浆液，并在加样过程中持续混匀匀浆液，以确保组织分布均匀。

单击 F4 以命名并记录事件的时间戳，然后单击“确定”。使用带有调节器和气体导管的氧气罐，通过钝头18号针头将50毫升注射器充满氧气。将氧气直接注入腔室，使腔室中的氧浓度升高至约500微摩尔。

松松地插入塞子，待氧气浓度降至约 480 微摩尔时再完全关闭。通过旋转动作缓慢关闭腔室，并让呼吸反应平衡约 15 至 20 分钟。如有需要，用 MiR05 填充塞子的中央毛细管。

使用专用微量注射器将底物、解偶联剂和抑制剂注入完全封闭的反应室中，并为每个反应室的事件实时命名和打时间戳。根据需要按 F6 键调整氧气浓度和氧气消耗速率的负向刻度。每次注射后，用水清洗注射器三次（适用于水溶性化合物），或用 70% 乙醇清洗三次（适用于乙醇溶解的化合物）。

加入5 µL 0.8摩尔的苹果酸，并立即进行下一次注射。用清水冲洗注射器三次。立即加入5 µL 1摩尔的丙酮酸，并等待呼吸速率稳定。

清洗注射器后，加入 10 微升 0.5 摩尔的 ADP，并等待 ADP 反应稳定。再次清洗注射器，加入 5 微升 2 摩尔的谷氨酸，并等待呼吸速率稳定。再次清洗注射器，然后加入 5 微升 4 毫摩尔的细胞色素 C，并等待呼吸速率稳定。

清洗注射器后，加入 20 µL 1-摩尔的琥珀酸，并等待呼吸作用稳定。以 0.5 至 1 µL 的增量逐次滴加 1-毫摩尔 FCCP，并在每次注射后等待呼吸作用稳定。重复此步骤，直至呼吸作用不再进一步增加。

用70%乙醇清洗注射器三次。加入2 µL 150 µM的鱼藤酮，并等待呼吸稳定。再加入1 µL鱼藤酮，以确保无进一步抑制作用。

如果呼吸作用降低，则继续进行额外注射，直至呼吸作用不再降低，然后用70%乙醇清洗注射器三次。加入2微升125微摩尔的抗霉素A，并等待呼吸作用稳定。再加入1微升抗霉素A，以确保无进一步抑制作用。

如果呼吸速率下降，则继续进行额外注射，直至呼吸速率不再下降。用70%乙醇清洗注射器三次。检查腔室中的氧气浓度。

如果浓度低于125微摩尔，需重新暴露于室内空气或轻度高氧环境中，以确保氧气不限制呼吸通量。加入5微升0.8摩尔的抗坏血酸。用70%乙醇清洗注射器三次。

立即加入10微升0.2摩尔的TMPD，并等待呼吸速率上升。当抗坏血酸-TMPD的呼吸通量达到平台期时，用乙醇清洗注射器后立即加入25微升4摩尔的叠氮化钠。通过点击文件、保存并断开连接来结束实验。

观察到，每毫升组织匀浆含40毫克时，会导致氧气迅速耗尽。当每毫升组织匀浆为30毫克和20毫克时，耗氧速度显著减慢，但在缺乏底物或ADP的情况下，短时间内仍会快速下降。每毫升组织匀浆含10毫克时，可获得最佳的氧气消耗速率。

采用SUIT方案评估了NADH和琥珀酸连接的氧化磷酸化及电子传递，以及复合体IV的活性。在丙酮酸和苹果酸，或琥珀酸和鱼藤酮存在下检测了细胞色素C的释放，两种条件均表明匀浆制备过程未损伤线粒体。此外还发现，EO771肿瘤中NADH连接的氧化磷酸化作用可忽略不计。

通过滴定FCCP以驱动最大电子流发现，在EO771肿瘤中，限制呼吸作用的因素是磷酸化而非氧化。肿瘤匀浆的呼吸特征与未移植的、经皂苷（digitonin）透化的EO771细胞相似，但肿瘤中由N链和S链底物支持的最大电子传递能力有所降低。通过逐步滴加亚饱和浓度的ADP直至达到最大速率，进一步评估了琥珀酸的呼吸动力学。

在存在琥珀酸和鱼藤酮的情况下，ADP 的半最大浓度为 37.5-微摩尔，而最大速率为每秒每毫克约 10.5 皮摩尔。常规护理中仪器的设置以及组织处理对这些实验的成功至关重要。遵循这些步骤后，可根据具体研究问题采用其他基于质量或标记物特异性的速率标准化方法。

常用的检测指标包括总蛋白定量和柠檬酸合酶的酶活性，但具体选择取决于模型系统、统计设计和研究问题。