评估线粒体功能在癌症相关性疲劳中的作用

本实验的总体目标是评估癌症患者疲劳症状与线粒体功能障碍之间的关联。该方法有助于回答支持性癌症治疗领域中的关键问题，例如，接受放疗后的癌症患者其疲劳症状是否与线粒体功能障碍相关。该技术的主要优势在于侵入性较小，可在临床环境中便捷地用于识别对癌症治疗毒性反应具有高风险的患者。

该技术不仅有助于加深我们对线粒体功能障碍在癌症相关性疲劳中作用的理解，而且还能改善评估并优化其管理策略。尽管该方法可揭示癌症相关性疲劳的潜在机制，但也可应用于其他导致疲劳的疾病状态，例如代谢性疾病和泌尿系统炎症性疾病。通常情况下，对于刚接触该方法的研究人员而言，在缺乏前期视觉演示的情况下，很难准确地将呼吸抑制剂注入传感器微孔板的各个孔中。

本实验操作由本实验室的博士后研究员Quang Nguyen先生进行演示。首先将传感器 cartridge 从包装中取出，然后向质控板的每个孔中加入200 µL校准液。

同时，向每个环形槽中加入 400 µL 校准液。随后将传感器板放回功能板，并在 37 °C 的无二氧化碳培养箱中过夜水合 cartridge。根据慢性病治疗功能评估量表（13 项）测量疲劳程度。

基线、中点、EBRT结束时及EBRT后一年的疲劳情况。首先准备用于线粒体功能检测的培养基。培养基配制完成后，将其预热至37摄氏度，并将pH值调节至7.4。

实验当天需制备检测培养基，并将其预热至37摄氏度，随后调节pH至7.4。接着将PBMCs接种至每孔中，使细胞汇合度达到80%至90%。然后以200 × g离心2分钟，使细胞贴附于孔板底部。

离心后，从每个孔中移除培养基，并用检测培养基洗涤孔一次。在每个孔中加入180微升检测培养基，包括背景孔。然后将培养板置于37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中孵育45至60分钟。

为了重悬药物，向寡霉素药物中加入252微升检测培养基，配制终浓度为50微摩尔的储备液；向FCCP药物中加入288微升检测培养基，配制终浓度为50微摩尔的储备液；最后，向抗霉素A/鱼藤酮药物中加入216微升检测培养基，配制终浓度为25微摩尔的储备液。

将三种药物重悬后，涡旋混悬液一分钟，然后稀释成工作液。随后，向A孔中加入20微升10微摩尔的寡霉素，使每孔终浓度为1微摩尔。接着，向B孔中加入22微升10微摩尔的FCCP，使每孔终浓度为1微摩尔。

最后，向C孔中加入25微升5微摩尔的抗霉素A/鱼藤酮，使每孔终浓度为0.5微摩尔。然后在细胞外通量仪上选择“线粒体应激测试”。接下来，根据仪器提示插入传感器微板。

仪器将自动执行传感器校准。校准完成后，插入细胞板，使仪器完成后续的检测步骤。为制备细胞增殖检测试剂溶液，将5.76 µL核酸染料和28.8 µL背景抑制剂加入1.405 mL磷酸盐缓冲液中。

在完成线粒体应激测试后，向每孔培养基中直接加入180微升2倍工作液。随后在37摄氏度条件下，用细胞增殖检测试剂孵育细胞45至60分钟。使用酶标仪在激发波长508纳米、发射波长527纳米条件下定量活细胞数量，随后对OCR数据进行归一化处理。

进行FCCP滴定实验时，1 µM是用于评估PBMC线粒体功能的最佳药物浓度。对线粒体呼吸及新鲜分离的PBMC进行研究发现，OCR在3小时开始下降，并持续至8小时。然而，由FCCP注射诱导的最大呼吸速率仍未超过基础OCR水平。

此处展示了来自两名健康个体的细胞线粒体功能的归一化结果。实际上，以绿色荧光DNA结合染料标记的活细胞归一化的耗氧率（OCR）在两名健康个体中相似。事实上，在健康个体与疲劳个体之间，基础耗氧率（OCR）未观察到显著差异。

然而，与对照组相比，疲劳受试者的最大氧消耗量和备用呼吸能力均有所下降。在健康受试者与疲劳受试者之间，非线粒体氧消耗、与ATP相关的氧消耗或偶联效率方面均未发现差异。若操作得当，掌握该技术后可在四小时内完成。

在进行该操作时，重要的是首先确定最佳的细胞密度和FCCP浓度。在此基础上，可进一步采用其他方法，例如分离不同的细胞群体，以指导未来针对特定细胞类型的机制研究。该技术建立后，为支持性治疗领域的研究人员探索线粒体功能障碍在疲劳癌症患者中的作用铺平了道路。

观看本视频后，您应充分了解如何测定线粒体功能，以及可用于主动识别因癌症治疗相关毒性（包括疲劳）而处于高风险患者的临床样本。请注意，操作呼吸抑制剂（如寡霉素和鱼藤酮）可能具有极高危险性。在进行该实验操作时，应始终采取佩戴个人防护装备等预防措施。