应用慢性刺激研究收缩活动诱导的大鼠骨骼肌表型适应

慢性收缩活动运动模型可用于在体内研究骨骼肌对运动训练刺激的适应性变化。特别是，该模型可在七天内模拟六周训练方案所引发的表型适应性变化。该方法有助于回答肌肉生理学领域的关键问题，例如线粒体生物合成、自噬以及其他多种与运动相关的细胞适应性变化。

该技术的主要优势在于，与需要数月时间的其他运动训练方案相比，它能够在短短七天的较短时间内观察到肌肉特异性的适应性变化。该技术的应用前景可延伸至肌肉萎缩性疾病的治疗，因为已有研究表明，慢性肌肉刺激能够改善与衰老相关的肌肉无力。通常，初次接触该方法的人员可能会遇到困难，原因在于定位腓总神经以及在两端安装电极线圈需要较高的操作精度和实践经验。

使用1%至3%异氟烷与氧气混合吸入法对大鼠进行麻醉，通过检测其对后肢脚趾夹捏的反应以及观察呼吸深度和频率来确认是否达到完全镇静状态。在眼睛表面涂抹眼用润滑剂以防止干燥，并将大鼠置于低至中等温度设置的加热垫上。轻柔地剃除左侧后肢的毛发，以及从颈部后方沿前肢后侧环绕躯干至前胸部的一条带状区域的毛发。

用碘伏和乙醇轻轻擦拭已剃毛的区域以消毒。将动物俯卧放置，使用带10号刀片的无菌手术刀，在颈部背面剃毛区域中央做一道约0.5厘米的小切口。然后将动物翻转至其右侧，于左侧后肢膝关节凹陷处与尾部起点之间，在皮肤上做一道2至3厘米长的切口。

使用钝头弯头手术剪在皮下区域进行分离，范围约为3.5至4厘米，将皮肤与下方肌肉分开，从而在开放的皮肤与下方肌肉之间形成一个囊袋。接下来，使用手术剪在股二头肌上做一个小于0.5厘米的小切口，确保剪刀尖端垂直向下切开肌肉。然后轻轻撑开切口区域，直至内部肌群和腓总神经清晰可见。

需格外小心，避免切割或损伤神经。接下来，准备 50 至 60 厘米长的聚四氟乙烯（PTFE）涂层细不锈钢丝，并将其对折。将导线的折叠部分钩入一根 30 厘米长的不锈钢棒的切口内。

使用金属牵开器将窗口拉开并固定，使窗口大小约为1.5平方厘米，腓总神经位于窗口中央。用手术刀小心剥离导线末端约1.5厘米。将导线通过后肢的开放袋状区域，沿腿部向上并沿背部中线以L形路径穿行，直至到达颈部后方的小切口处。

将剥去绝缘层的导线末端围绕钝化的21号针头缠绕五圈，形成线圈。线圈制作完成后，将针头从线圈中取出。在线圈末端打一个结，并将其缝合在神经的左侧，确保线圈与神经的距离为1.5至2.5毫米。

为了固定线圈，需在线圈上再缝合两到三针。此步骤需要大量的练习和耐心，以避免损伤神经及下方肌肉，并确保所有动物的刺激条件一致。最好由一名技术熟练的研究人员完成研究中的所有手术操作。

滴加两到三滴抗生素溶液，然后用5-0丝线仔细缝合窗口。将多余的导线松散地缠绕后，推入髋部上方缝合切口处股二头肌的皮下囊袋中。再次滴加两至三滴抗生素溶液，然后用缝合钉闭合皮肤切口。

接下来，将动物移至胸卧位，剪断从颈部顶端切口处引出的导线环，形成两个导线端。使用手术刀剥离导线末端约0.5厘米的绝缘层。剪除任何散乱的导线。

将导线剥除绝缘层的部分缓慢插入针座的孔中，使用电烙铁将导线焊接到针座上。将连接有针的导线末端穿过一块4.4厘米的无菌纱布垫。然后将导线穿过刺激器盒底部的孔。

将插针插入 CCA 单元的连接插座中。使用粘性橡皮将 CCA 单元底部固定于腔室底部，轻柔地将 CCA 单元放入腔室内。使用运动胶带或透气性外科胶带将腔室固定在剃毛后的躯干周围。

用三层胶带封闭刺激室的顶部，然后将胶带缠绕在刺激器盒的侧面，以固定盒子。通过将设备暴露于便携式红外频闪灯发出的单次红外光脉冲下，检查CCA是否正常工作。

如果CCA正常工作，后肢肌肉将对红外光产生收缩反应。在开始CCA操作前，应尽快对动物进行称重，以记录基线数据，有助于通过CCA操作后体重的变化识别是否存在严重应激或不良反应。在CCA刺激当天，通过便携式红外频闪灯向刺激单元发射单次红外光脉冲来启动CCA，并施加3小时或6小时的10赫兹CCA刺激。

每30至60分钟检查一次刺激装置和动物状态。达到预期的CCA干预周期后，通过红外光照射关闭CCA设备。每日接受六小时、持续七天的CCA干预的大鼠，其受刺激侧肌肉的线粒体生物合成较未受刺激的对侧后肢明显增强。

线粒体生物合成的增加表现为PGC-1α蛋白表达水平升高。通过检测透化肌纤维的线粒体呼吸能力发现，与对照组肌肉相比，CCA处理导致肌肉最大呼吸能力增强。与未刺激的对照肌肉相比，连续7天CCA处理后，肌膜下和肌原纤维间线粒体群体均有所增加。

CCA 也可引起自噬和溶酶体系统的适应性变化。在 CCA 后的所有时间点，均观察到溶酶体生成主要调节因子——转录因子 EB 的蛋白质丰度增加。在此操作之后，可进行其他方法，如常规皮下注射或腹腔注射，以回答更多问题，例如通过秋水仙碱处理来评估自噬流。

观看本视频后，您应能够充分理解如何应用当前的慢性收缩活动模型，以研究耐力训练后肌肉表型的变化。