啮齿类动物心肌细胞收缩功能障碍与Ca²⁺瞬变的分析

该方法可检测心力衰竭发展过程中收缩功能的变化。还可用于筛选心肌细胞对神经激素及潜在治疗药物的功能反应。心肌细胞的定位可能需要反复练习，但对于获得稳定的肌节长度成像至关重要。

演示该实验步骤的是实验室的副教授兼首席研究员 Margaret Westfall。在开始实验之前，将凝胶包和培养基放入37摄氏度的培养箱中预热30分钟。按照文稿中所述，打开收缩功能平台的各个组件，并将管路装配到蠕动泵中。

然后，将预热的凝胶包放入试管架中，并接通细胞刺激仪的电源并开启真空。将装有培养基的50毫升试管放入隔热试管架中，通过蠕动泵管以每分钟0.5毫升的速度开始灌注。接着，向一个小的称量舟中加入2毫升预热的培养基，并将一片含有心肌细胞的盖玻片从刺激室转移至该称量舟中。

将刺激室放回 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中。从称量舟上取下盖玻片，轻轻擦拭其底面，然后转移至涂有新鲜润滑脂的盖玻片腔室，并在盖玻片上滴加一滴培养基。将铂电极支架置于盖玻片上方，然后用镊子将一片新的盖玻片覆盖在顶部，再将上部支架放置在盖玻片夹层结构上。

安装两个或四个零号平头螺钉以完成腔室的组装。当培养基已充满蠕动泵的管路时，将管路连接至预加热器，再将预加热器连接至盖玻片腔室。随后以 0.5 毫升/分钟的流速开始灌注，并在腔室下方放置一张吸水纸巾，以确保无泄漏。

将盖玻片腔室放入显微镜的载物台适配器后，打开加热系统，使装置平衡5到10分钟，以确保腔室中心的培养基温度恒定在37摄氏度。观察通过连接至真空系统的管路在腔室另一端收集到的灌注培养基。在平衡期间，使用显微镜上的40倍水浸物镜观察心肌细胞。

启动起搏刺激器时，将电压设置为 35 至 40 伏特，并将刺激频率调节至 0.2 赫兹，以优化收缩功能和心肌细胞存活率。为采集肌节缩短轨迹，打开计算机上的软件，依次选择确定、文件和新建选项卡。通过选择轨迹、编辑用户限值和肌节长度，准备屏幕模板。

使用文件和新建选项卡记录肌节长度轨迹，识别一个正在收缩的心肌细胞，并将其沿相机的纵向轴线摆放，使横纹模式呈垂直方向。使用计算机鼠标将感兴趣区域（ROI）框放置在心肌细胞上。选择“采集”并开始记录收缩功能。

在0.5赫兹的低刺激频率下，从每个心肌细胞记录60秒的缩短情况。每张盖玻片上记录5至10个细胞的肌节缩短。为测量不同频率下的缩短情况，需将心肌细胞在各个频率下稳定至稳态缩短后再进行记录。

将灌注速率加倍，并在以0.2至2赫兹范围内新的频率刺激后15到20秒开始记录，每个盖玻片上针对给定刺激频率范围内的缩短反应记录不超过两个心肌细胞。每个细胞至少记录七次收缩，以获得可靠的信号平均数据。选择文件，选取一条记录的轨迹，然后选择打开。

选择基线轨迹的第一个选项卡，然后调节轨迹顶部的黄色面板以获取肌小节长度。在菜单中必要的选项下，通过定义T零框中的单调瞬态分析选项和TTL事件标记，创建一个分析模板。通过选择模板并使用标识符保存分析模板，将这些分析选项保存下来。

在分析每条轨迹之前，加载分析模板。要分析数据，请选择标记、设置门控、添加瞬态，然后从事件标记和分析范围进行转换。对于以 0.2 赫兹起搏的心肌细胞，将时间范围设置为 -0.01 至 1.20 秒。

对于以较高频率刺激的心肌细胞，选择较短的时间范围。选择相应操作并平均化事件，以在原始基线轨迹下方生成平均信号记录。接着，选择平均信号轨迹的第一个标签，然后在上方菜单中点击“标记”（Marks），随后选择“添加瞬变”（add transient），再选择操作中的“单调瞬变分析”（monotonic transient analysis），以在平均信号显示面板中显示基线肌节参数的平均信号值。

选择导出单音瞬态分析，并将电流和传递瞬态肌节分析复制到电子表格中，以进行多个心肌细胞的综合分析。要复制信号平均迹线，请依次选择“导出”、“电流迹线”、“剪贴板”和“选项”标签，并将小数位数设置为五位。选择制表符作为分隔符，然后单击“确定”。

将每个心肌细胞记录的信号平均迹线排列到第二个电子表格中。该研究显示，与假手术组相比，压力超负荷（PO）会降低心肌细胞的收缩功能。然而，在心脏肌钙蛋白IT144D（cTnIT144D）基因转导后的第四天，PO心肌细胞的收缩能力恢复至接近假手术组水平，表明心肌细胞功能可被恢复。

在早期研究中，与CTnI相比，cTnIT144D的基因转移增强了峰值缩短程度，并提高了舒张期钙水平。通常需要对心肌细胞的位置进行精细调整，以获得清晰的缩短轨迹。此外，该方案还可用于加载了钙敏感荧光染料（如Fura-2 AM）的心肌细胞，以同时检测钙瞬变和细胞缩短。