胰岛表面肝素化星形PEG纳米涂层工程

该方法有助于解决胰岛移植中的主要难题，例如免疫排斥、移植后胰岛的再血管化以及细胞存活问题。该技术的主要优势在于，这种易于采用的方法可通过重塑胰岛细胞的表面结构，实现对活细胞的表面工程改造，从而改善移植物的功能、存活率，最终提高胰岛移植的治疗效果。该技术的影响还延伸至细胞治疗领域，因为细胞治疗的疗效同样受限于细胞滞留率低和存活率差的问题。

演示该实验步骤的是我实验室的研究生 Jingyi Yang。首先，称取 6.9 克肝素（Heparin），加入 2 毫升预冷的去离子水中，在 Eppendorf 管中溶解。另取 0.23 克 NHS，溶于 0.5 毫升预冷的去离子水中，同样在 Eppendorf 管中溶解。

然后，在50毫升锥形管中，将0.77克EDC溶解于0.5毫升预冷的去离子水中。在50毫升锥形管中混合NHS溶液与EDC溶液。将混合溶液在室温下静置30分钟后，以12,000 RPM离心10分钟，以去除过量的EDC和NHS。

随后，向溶液中加入 30 毫升冷乙醇，在 12,000 RPM 条件下离心 10 分钟。接着，向一个 50 毫升锥形管中加入 1 毫升 10% starPEG MI 辅助剂。然后向同一 50 毫升锥形管中加入 0.67 毫升 10% 肝素 NHS 溶液。

将混合溶液置于25摄氏度的培养箱中孵育20分钟，得到黏稠的澄清溶液。在解剖显微镜下手工挑选200个先前提取的小鼠胰岛，并转移至1.5毫升离心管中。向胰岛中加入500微升PBS，于4摄氏度、1,200转/分钟离心1分钟。

弃去上清液，加入250微升肝素PEG溶液，将混合物置于冰上10分钟。用移液器吹打混匀，使胰岛与肝素PEG溶液充分混合。随后，将混合物在1,200转/分钟下离心1分钟。

然后，弃去上清液，加入 500 µL PBS。用移液器吹打混匀。在 1,200 ×g 下离心 1 分钟后，弃去上清液，保留胰岛用于后续实验。

接下来，向包被的胰岛中加入一到两毫升 RPMI 1640 培养基（添加 10% FBS）。然后将这些胰岛转移至无电荷的无菌细菌培养皿中。最后，在倒置荧光显微镜下观察 FAM-肝素-PEG 包被胰岛的形态及荧光信号。

在肝素-PEG纳米涂层的FTIR光谱中，观察到对应于HYDROXAL基团的特征性肝素峰。这些峰强度的降低表明星形PEG MI的酰胺基团与肝素的羰基发生了偶联反应。对应于酰胺羰基伸缩振动的峰也有所减弱，表明肝素的羧酸根与琥珀酰亚胺基琥珀酸以及星形PEG MI的氨基之间发生了充分的反应。

电子显微镜数据扫描显示，肝素-PEG纳米涂层具有高度相互连通的多孔结构，表明其可能适用于体内递送过程中细胞的存活。绿色荧光显示一层薄薄的纳米涂层均匀地沉积在包被的胰岛表面，未引起胰岛体积或大小的明显变化。肝素-PEG包被的小鼠胰岛在培养中表现出良好的胰岛活力。

与涂覆肝素-PEG的胰岛共培养的胰岛内皮细胞表现出显著更高级的血管形成，表现为细长的微血管样结构和网络状血管结构。当胰岛灌注含有亚刺激浓度葡萄糖的生理盐溶液时，所有处理组均观察到较低水平的胰岛素分泌。当胰岛受到超生理浓度葡萄糖刺激时，胰岛素分泌增加。

一旦掌握，若操作得当以保持胰岛活性，包被过程可在一分钟内完成。