用于微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器：制备、系统搭建与操作

本实验的总体目标是利用微流控培养装置，在环境条件恒定的情况下，对单个细菌及其演化的同基因微菌落进行具有完整空间和时间分辨率的分析。该目标首先通过使用计算机辅助设计（CAD）软件设计微流控培养系统来实现。随后，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备一次性微流控培养装置，该装置包含皮升级生物反应器，其高度为一微米，以限制细菌生长为单层结构。

将微生物培养物注入微流控装置，以在生物反应器中接种单个母细胞。通过系统持续灌注培养基，使这些细胞不断扩增。实验结果来自自动化的延时显微成像，展示了工业相关谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）菌株的培养过程、生长数据以及细胞间的异质性。

在传统的生物技术中，大多数分析基于平均数据。我们的微流控设备能够以空间和时间分辨的方式对单个细菌进行单细胞分析。该设备是深入研究同基因型微菌落中细胞间异质性的有力工具。

我们采用常见的SU-8光刻技术和聚二甲基硅氧烷芯片模塑工艺，制造具有亚微米级介质分辨率的一次性微流控装置。我们已成功将该技术应用于多种生物技术微生物，如大肠杆菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）。首先，使用CAD软件设计微流控装置。

本方案中呈现的设计包含两个接种入口、一个用于混合两种不同底物的梯度发生器、一个出口，以及由五个生物反应器组成的六个阵列。在洁净室中，准备一片四英寸的硅晶圆，并按照随附文本方案中的描述，在晶圆上旋涂一层厚度为一微米的 SU-8 2000.5 光刻胶。将涂覆好的晶圆置于 95 摄氏度的加热板上，以去除多余的溶剂，随后将第一层光掩模（包含皮升级反应器的捕获区域）与涂覆好的晶圆一同放入掩模对准仪中。

然后，将晶圆置于真空接触模式下，用波长350至400纳米的光照射3秒，光强为7毫瓦/平方厘米。在水平的热板上进行曝光后烘烤，温度为95摄氏度，以引发SU-8的聚合反应。接着，将晶圆放入SU-8显影液中浸泡1分钟，随后将晶圆转移至另一装有新鲜SU-8显影液的容器中，继续处理数秒钟。

用异丙醇冲洗晶圆，以去除SU-8显影液，并使用氮气流或晶圆甩干机将晶圆干燥。随后，在150摄氏度下对晶圆进行10分钟的坚膜烘烤。接下来，按照随附文本方案中所述制备第二层，以完成母模的制作。

开始PDMS芯片的制备，将基础剂与固化剂按10比1的比例混合。将PDMS混合物置于真空干燥器中脱气约30分钟，直至所有气泡完全消失。接着，将SU-8晶圆放入模具装置中，并在晶圆表面浇注一层3毫米厚的PDMS混合物。

然后，将PDMS在80摄氏度的烘箱中烘烤3小时。待其冷却后，小心地将PDMS块从硅片上剥离，并使用洁净锋利的手术刀将PDMS块切割成单个芯片。将芯片在正戊烷浴中清洗90分钟，随后分别用丙酮清洗两次，每次90分钟。

将芯片在室温下干燥过夜，以去除任何溶剂残留。在实验开始前，使用针头或打孔器在PDMS芯片上打出入口和出口孔，所用针头或打孔器的直径应略小于用于连接管路与PDMS芯片的接头直径。接着，用异丙醇仔细清洗微流控PDMS芯片，并使用透明胶带去除附着的灰尘颗粒。

此外，先用丙酮、再用异丙醇、最后用去离子水清洗一片170微米厚的玻璃载片，然后用氮气流吹干。待载片清洁并干燥后，使用50瓦功率和20 sccm的氧气流速对玻璃载片和PDMS芯片进行25秒的等离子氧化处理。随后，在将PDMS置于玻璃上之前，仔细对齐PDMS与玻璃芯片，这会使两者在数秒内键合。

在80摄氏度下烘烤装置10秒以加固键合。为准备芯片实验用的细菌，挑取一环所需菌株（如谷氨酸棒状杆菌 *C. glutamicum*）的单菌落，接种于20毫升新鲜BHI培养基中，在30摄氏度、120 RPM的摇床中过夜培养。次日早晨，取10微升种子培养物转移至含有20毫升目标培养基的第二代培养物中，并在相同条件下过夜培养细胞。

第二天，将倒置显微镜的培养箱预热至30摄氏度。根据具体设备情况，此过程可能需要长达两小时。在设备升温的同时，打开培养箱，选择所需物镜，并使用必要的封片介质进行准备。

然后，将芯片安装到芯片支架内并固定。将样品置于显微镜下居中，并聚焦于皮升级生物反应器阵列。当芯片处于焦点时，使用适当的管路连接入口和出口，然后将出口管路放入废液储液池中。

接下来，用新鲜培养基填充注射器，将其放入注射泵中，并以每分钟200纳升的流速冲洗微流控通道一小时，以启动芯片。在细胞仍处于对数生长期初期时，将一毫升细菌培养物转移至无菌注射器中，并用该细胞悬液和新的管路替换原先装有培养基的注射器和管路。以每分钟200纳升的体积流速将细胞悬液注入通道，直至大多数皮升级生物反应器被填满。

如果仅填充少量生物反应器，则将流速提高至每分钟 800 至 1200 纳升。当接种的细胞数量达到预期后，断开细胞悬液，重新连接培养基至芯片，并以每分钟 100 纳升的速度灌注新鲜培养基。随后，扫描芯片并选择特定的生物反应器进行延时成像。

然后，设置一个延时显微成像程序，以全程记录生物反应器的图像并开始实验。当所有皮升级生物反应器均过度生长后，停止实验并妥善丢弃芯片。开始分析时，首先确定哪些生物反应器满足实验的全部预期标准，例如母细胞的数量和位置。

使用 ImageJ 等分析程序，通过统计每个时间点的细胞数量来确定每个微菌落的生长速率。通过绘制时间与细胞数量对数的关系图，计算最大生长速率。本系统可用于研究不同细菌种类在生长、形态或荧光信号等生物学参数方面的特性。

在此示例中，谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）在标准培养条件下进行培养，并展示了由三个同基因型微菌落获得的生长曲线。皮升生物反应器结合延时荧光显微镜技术，也被证明可用于研究蛋白质的表达情况，如图所示。通过向细胞施加低浓度的蛋白质诱导剂IPTG，可从单个母细胞开始，在单细胞水平上研究菌落内细胞间的蛋白质表达差异。

本演示技术可用于在完全可控的环境中对单个细菌细胞进行监测和分析，而使用传统的台式培养系统几乎无法实现这一目标。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备微流控培养芯片，以开展可比的单细胞分析。