利用点击化学可视化植物木质化动态：双重标记即为 BLISS！

该双重标记方法的总体目标是观察植物组织中正在活跃木质化的区域。在此工作流程中，采用两种不同的化学报告分子，通过连续的生物正交点击化学反应组合来实施化学报告策略。该方法有助于解答植物生物学领域的一些关键问题，例如确定调控植物及其细胞壁中木质素空间或时间形成的关键因素。

该技术的主要优势在于能够特异性地靶向代谢整合过程中新生成的木质素，从而将其与样品中任何预先存在的木质素区分开来。尽管我们最初开发该方法是为了研究木质化标志物，但它也可应用于其他物种，例如拟南芥、杨树，或任何能够产生木质素的植物。

为了展示这一技术，我们邀请了克莱门斯·西蒙（Clemence Simon），她是一名博士生，研究工作处于化学与生物学的交叉领域，并正在利用该技术研究木质化动态过程。首先，配制300微升化学探针溶液，其中包含10微摩尔的炔烃标记G探针、10微摩尔的叠氮标记H探针，以及液体无菌1/2 MS培养基。

将溶液涡旋混匀，并用移液器转移至一个48孔板的孔中。配制300微升的阴性对照溶液，其中包含10微摩尔的G、10微摩尔的H以及液体无菌1/2 MS培养基。将该溶液涡旋混匀后，转移至同一48孔板的第二个孔中。

使用洁净的剃须刀片，在亚麻植株距土壤表面10厘米处切割茎秆。用剃须刀片仔细制作50片茎秆的徒手横切切片，并立即将其放入1/2 MS培养基中。随后，挑选完整无损的横切切片，随机选取10片放入盛有化学报告分子溶液的孔中，注意避免损伤组织。

切片必须切得牢固且干净，切面需保持平直。为了保持组织完整，需要稳定的手法和锋利的刀片。建议事先进行练习。

将十个完整的横切面放入阴性对照溶液后，于20摄氏度的培养室中在持续光照条件下孵育20小时。次日，用微量移液器移除各孔中的单木质素溶液。向每孔加入500 µL的1/2 MS培养基，并轻轻搅拌10分钟。

然后，用微量移液器移除洗涤液。准备一毫升应变促进的叠氮-炔环加成溶液，其中包含五微摩尔环辛烯标记的荧光染料和液体无菌1/2 MS培养基。

然后，涡旋溶液。在代谢标记实验方案的最后洗涤步骤后，移除1/2 MS培养基，并用移液器向每个孔中加入300 µL的SPAAC溶液。将48孔板放入盒中以避光。

然后，在室温避光条件下，将培养板置于机械振荡器上轻轻振荡搅拌一小时。随后，按照前述方法，用1/2 MS培养基将每孔洗涤四次，期间保持培养板处于避光环境中。配制一毫升铜催化的叠氮-炔环加成反应溶液，其中包含抗坏血酸钠、硫酸铜、叠氮标记的荧光染料以及液体无菌1/2 MS培养基。

然后涡旋混匀溶液。去除1/2 MS培养基后，将培养板放入盒中，用微量移液器向每孔加入300 µL的CuAAC溶液。在室温避光条件下，将培养板置于机械振荡器上轻轻振荡孵育一小时。

从机械振荡器中取出培养板，用移液器从每个孔中移除CuAAC溶液。然后，向每孔加入500微升1/2 MS培养基，在黑暗条件下将培养板置于机械振荡器上振荡10分钟。用1/2 MS培养基再洗涤两次后，向每孔加入500微升甲醇与水按7:3比例配制的溶液。

在避光条件下，将培养板置于机械摇床上振荡一小时。然后，移除各孔中的溶液。接着，向每孔中加入500微升1/2 MS培养基，并在避光条件下振荡十分钟。

重复此洗涤步骤四次后，将横切面保存在1/2 MS培养基中，并避光存放。在玻璃显微镜载玻片上滴加五滴封片剂，然后小心地将每一个化学探针标记的横切面置于载玻片上。

在载玻片相对的两侧涂抹指甲油。盖上盖玻片，注意避免产生气泡。然后用纸巾吸去多余的封片介质。

随后，用指甲油在样品的四个边封片。待指甲油完全干燥后，将载玻片置于四摄氏度避光保存，直至使用共聚焦显微镜观察。植物切片在干燥后容易变脆。

务必始终使其保持在溶液中，并用指甲油在盖玻片的所有边缘进行封固。这可以延长封片的保存期限。将样本载玻片置于物镜下的显微镜载物台上。

观察并旋转样品，以确定植物组织中目标区域。接着，在Z轴上选择荧光信号最强的焦平面。调节增益、偏移量和激光功率，使每个通道的信号在整个灰度范围内达到最佳分布。

最后，获取高质量的共聚焦图像。BLISS 可提供植物细胞壁内木质素的三色定位图谱，专一性地标记代谢整合过程中从头合成的木质素，并将其与样品中预先存在的木质素区分开来。该方法能够突出显示器官不同组织内、组织内不同细胞类型中，或细胞不同壁层及亚结构中的活跃木质化位点。

从亚麻次生木质部的形成层到髓心，带有烷基标记的G和叠氮标记的H报告分子的掺入分布表明，在纤维管胞的发育过程中，木质素化迅速达到峰值；而导管细胞在其生命后期的较晚阶段仍持续掺入木质素。通过改变化学报告分子的比例，证明次生木质部组织中木质素的组成直接取决于细胞壁内单体木质素的可利用性，而非依赖于木质素聚合过程中过氧化物酶或漆酶的特异性。

化学探针的掺入仅限于部分（而非全部）韧皮纤维的细胞角隅和中胶层初生细胞壁。在亚麻根中，化学探针掺入于凯氏带缺失的内皮层细胞壁中。为了更清晰地展示组织结构，还可生成三维Z轴堆叠重建图像。

完成此可视化操作后，还可进行全面的数据处理。在采取所有预防措施的前提下，通过相对比较法读取不同样本之间的样本，可以获得稳定的结果。此外，还可实现对不同区域活性前沿的定位。

该方法对于像我这样研究细胞壁的植物生物学家而言，是一种极佳的工具。一旦掌握，可在数小时内完成。该方法非常灵敏，可应用于多种不同的体外和体内实验模型系统。

将化学报告分子策略应用于木质素，为化学生物学家探索木质化动态过程以及揭示控制这一聚合过程的机制开辟了道路，而在许多方面，该领域至今仍属未知疆域。