结合透明化技术与荧光显微镜观察基因表达变化及对Plasmodiophora brassicae的生理响应

芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）是一种土传的专性活体营养型病原菌，可侵染十字花科（Brassicaceae）植物。侵染后，该病原菌会诱导植物地下部分形成根瘤，因此该病害被称为根肿病。根瘤的形成伴随着极为复杂的重编程过程。

因此，在疾病发生过程中追踪内部变化的可能性，对于理解这种植物-病原体互作至关重要。我们的实验方案改进了对结构复杂、组织较厚以及虫瘿的成像效果，便于观察基因表达变化、生理响应、植物激素平衡、病害发展进程、孢子分布以及局部木质化等现象。

该方案可保护样品中的荧光蛋白，实现对样本的长期保存和处理。同时，它还能够追踪伴随疾病进展发生的生化和结构变化。本次实验操作将由本课题组的博士后研究员 Sara Blicharz、本实验室的博士研究生 Deeksha Singh，以及来自亚当·密茨凯维奇大学 Agnieszka Bagniewska-Zadworna 教授课题组的博士研究生 Kornel Michalak 演示。

首先准备植物组织。小心去除根肿病感染植株和未感染植株根系上的土壤，用清水彻底清洗，并将下胚轴和根瘤收集到微量离心管中。

使用真空泵施加 700 毫巴的恒定真空，在室温下用 200 至 500 微升多聚甲醛固定液固定样品 1 小时。确保样品完全浸没在多聚甲醛溶液中。使用 4% 琼脂糖包埋未感染的下胚轴和感染的根瘤。

将溶液煮沸以溶解琼脂糖，待其冷却但仍保持黏稠时倒入。将样品在纸巾上轻轻干燥数秒，以去除多余的多聚甲醛。使用牙签或镊子小心地将植物样品包埋并调整其在琼脂糖中的方向。

为防止产生斜切面，应确保样品方向正确并包埋妥当，使其轴线与振动切片机刀片平面垂直。为加速琼脂糖凝固，可将培养皿或多孔板置于4°C环境中10分钟。使用刀片在琼脂糖块内小心切割并塑形样品，注意标记切片时的优选方向。

使用氰基丙烯酸酯胶水或快干胶以及医用胶带，将琼脂糖块或较大的虫瘿牢固地粘附在样品台上。根据虫瘿的厚度和大小，调整切片厚度、切片速度和振动幅度。向水浴中加入蒸馏水，开始切片。

使用镊子或毛刷小心收集组织切片，并将其转移至含有1毫升1×PBS缓冲液的微量离心管中。移除微量离心管中的1×PBS，加入200至500微升透明化溶液。在样品处理过程中，若透明化溶液颜色随时间发生变化，需更换为新的透明化溶液。

通过在透明溶液中配制5%的Calcofluor White染液，对植物外层细胞的细胞壁进行染色。然后在避光条件下染色至少五分钟。按照文本稿件中的描述，用尼罗红染脂质，用碱性品红染木质素，并将透明处理后的切片置于显微镜载玻片上观察。

然后在落射荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察细胞。采用多种采集模式，以同时成像多个荧光光谱。通过尼罗红染色后，可追踪被芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）定殖的根瘤中的疾病动态及病原体积累情况，并观察到含有P. brassicae休眠孢子的大型细胞。

利用碱性品红染色法观察了根肿菌（P.brassicae）侵染后木质部分化的变化。使用携带pHCA2:erRFP构建体的拟南芥植株，以观察根肿瘤中韧皮部组织内HCA2基因的表达。在根肿菌诱导的瘤状结构发育的后期阶段，HCA2与韧皮部共定位，其基因活性反映了根肿菌增加韧皮部复杂性的分子机制。

接种后16天，通过检测发育中虫瘿中TCS:GFP标记的表达情况，评估了感病植株与非感病植株之间细胞分裂素响应的差异。在感病虫瘿中，细胞分裂素响应明显减弱，而在非感病植株中则保持较强，尤其在韧皮部区域更为显著。最关键的步骤包括PFA固定、包埋和切片。

进行振动切片时，需要优化并仔细调整速度、振幅和厚度参数，以获得高质量的切片。振动切片与组织透明技术为增强显微分析植物-微生物互作过程中的生理响应以及具有次生生长和复杂细胞结构的组织提供了重要途径。