利用Calcofluor对苔藓Physcomitrium patens中细胞壁动态进行三维延时成像

利用荧光显微镜进行延时成像，可观察细胞及亚细胞水平上生长与发育的动态变化。该三维延时成像的简易方案可直接长期研究细胞壁的动态变化。本方案使用Calcofluor染料标记细胞壁厚度的动态变化，因此无需转化荧光蛋白。

荧光增白剂信号稳定，可维持超过一周。该方法可应用于许多具有细胞壁且结构简单的其他体系，只要这些体系能被荧光增白剂染色，例如开花植物。在本方案中，整个延时成像过程中，染料与培养基混合后，荧光增白剂信号保持稳定。

首先，将7天大的苔藓组织分散到含有20微升无菌水的1.5毫升微量离心管中。对于野生型，使用镊子分离原丝体；对于ggb突变体，则使用AP-1000移液器分离原丝体。

向微量离心管中加入10 µL灭菌的Calcofluor-white溶液，在生物安全柜中直立放置2分钟进行染色。染色后立即用P1000移液器吸取200 µL预冷的含BCDAT培养基的BCDATG溶液，反复吹打混匀5次，然后将混合液转移至27 mm玻璃底培养皿中。确保含有样品的200 µL BCDATG溶液均匀分布在27 mm玻璃底培养皿表面，形成一层薄液膜，以便在成像时样品处于物镜工作距离范围内。

在室温下凝固两分钟后，用三毫升冷却的BCDATG覆盖薄层，并静置10分钟使其再次凝固。在培养皿底部绘制九条相互平行和垂直的线，用字母A至H标记行，用数字1至8标记列。使用上、下、右、中、左来标记每个方格内的位置。

例如，如果一株植物位于第二行第六列的方格内，并且处于该方格的左上部分，则该植物被命名为 b6 左上。在进行每天延时成像之前，将玻璃底培养皿置于白光下 1 至 2 天，最长持续 3 天。要重建 3D 图像，请打开 ND2 文件并点击“体积”。

在第0天、第1天、第3天和第4天重建细胞壁。每次拍摄图像后，将玻璃培养皿放回生长室。通过荧光增白剂白染色显示野生型和ggb突变体中隔膜的动态变化。

对于 ggb 突变体，每张图像下方的白色虚线表示扩张细胞中破裂的表面细胞壁，橙色线条表示 ggb 中位于细胞壁表面下方的细胞。细胞表面位置上的荧光增白剂-白（calcofluor-white）信号差异可以被检测到，染色较稀疏的区域表明 ggb 突变体中的细胞扩展或野生型中新的分支位点。对于野生型的预培养，需要将植物在上方的弱红光下培养五天，以诱导原丝体的向光性反应，从而使植物能够附着在培养皿底部，并在成像时位于物镜工作距离范围内，因为荧光增白剂-白可与其他染料（如微球）联合使用。

关于细胞扩增的其他信息也可进行研究。植物细胞壁的动态变化对于有效的生长发育以及对环境信号的响应至关重要。本方案可直接对细胞壁信号变化的分裂过程进行观察和整合分析。