利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

本方法的总体目标是在小鼠胚胎发育过程中，鉴定克隆性造血干细胞（HSC）或HSC前体细胞的表型特征及其移植潜能。该方法有助于解答发育性造血领域中的关键问题，即克隆性HSC前体细胞在胚胎发育过程中独特的谱系贡献。该技术的主要优势在于，可在单细胞水平上分析生血性前体细胞。

这有助于鉴定出区分稀有造血干细胞前体的独特表型特征。首先，将交配后9.5至11.5天胚胎中分离的主动脉-性腺-中肾区（Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM）组织加入预冷的含10毫升PBS（补充10% FBS）的15毫升锥形管中，置于冰上。待组织沉降至管底后，吸除上清液，并立即向样品中加入1毫升0.25%胶原酶。

在37摄氏度水浴中孵育25分钟后，加入1毫升含FBS的PBS终止反应，使用1毫升移液枪头将组织吹打20至30次，直至获得单细胞悬液。随后用额外8毫升含FBS的PBS稀释细胞，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于500微升封闭缓冲液中，冰上孵育5分钟。

然后加入500微升目标抗体混合液。在冰上孵育15至20分钟后，用8毫升含FBS的PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于1毫升新鲜的含FBS的PBS中。通过35微米细胞筛网将细胞过滤至5毫升离心管中，并用额外的3毫升含FBS的PBS冲洗筛网，以收集全部细胞，随后再次离心细胞。

然后将沉淀重悬于500 µL PBS加FBS中，并将细胞置于冰上。为在单细胞和索引分选模式下设置分选门，取少量细胞上样至流式细胞仪，并将采集流速设为最低。打开前向散射面积对侧向散射面积图，设置一个门以包含不同大小的细胞。

打开前向散射面积对前向散射宽度图以及侧向散射面积对侧向散射宽度图，并在每个图中设置门控以排除双联体。设置前向散射面积对DAPI图以圈选活细胞。然后创建抗血管内皮钙黏蛋白对抗内皮蛋白C受体图，并圈选血管内皮钙黏蛋白阳性且高表达内皮蛋白C受体的细胞。

为了对主动脉-性腺-中肾细胞进行索引分选，将预先在AGM无血清培养基（含细胞因子）中培养了AGM内皮细胞的96孔板放入流式细胞仪的板架中，并加载实验样品。开始采集样品时，确认已选择索引分选单细胞模式，以便将单个细胞分选至96孔板的每个孔中。当每个孔均已分选入一个细胞后，将该板置于设定为37摄氏度和5%CO2的组织培养孵育箱中，培养最多七天。

共培养期结束后，可在100倍放大倍数下使用倒置显微镜观察到不同大小和形态的造血克隆。为通过流式细胞术分析克隆，使用多通道移液器将造血细胞从内皮层上解离，注意不要使内皮细胞脱落。随后，将100微升细胞转移至新的96孔V型底板的各个孔中，并将含有剩余100微升细胞的原始96孔板放回组织培养孵育箱中继续培养。

通过离心在V型底板中沉淀细胞，并通过快速倒置并轻弹平板的方式移除上清液。在每个孔中加入50 µL封闭缓冲液，在4 °C下重悬沉淀。5分钟后，向每孔加入目标抗体混合物，在4 °C下孵育20分钟。

孵育结束后，每孔加入200微升含FBS的PBS洗涤，离心结束后轻弹培养板以弃去上清。将沉淀重悬于50微升含FBS的PBS中，并根据标准流式分析方案分析细胞，以筛选含有具有造血干细胞潜能的克隆。通过流式分析选择含有具有造血干细胞表型细胞的孔，使用多通道移液器将原始共培养体系中剩余的100微升细胞重悬，并向每孔中加入100微升含2% FBS的PBS中含5 × 10⁴个挽救型骨髓细胞。

在将每个克隆分别过继转移至致死剂量照射的同源受体动物后，定期采集移植后受体动物的外周血样本。为鉴定具有长期植入能力的克隆，应按照标准流式分析方案对样本进行流式细胞术分析。随后可将每个克隆的表型特征与其植入特性进行关联分析。

通过血管内皮钙黏蛋白阳性及内皮蛋白C受体高表达，可富集前体造血干细胞。使用其他荧光染料偶联抗体进行染色，可对分选过程中记录的每个细胞的额外表型参数进行回溯性分析。将细胞经索引分选后接种至主动脉-性腺-中肾区血管内皮细胞共培养体系，单个克隆首先整合入主动脉-性腺-中肾区血管内皮细胞层，随后克隆细胞变圆并形成造血细胞簇。

经过五到七天的共培养后，可观察到大小和形态各异的克隆集落。此处展示了共培养后获得的四种不同集落，其中三个集落显示出不同比例的表型造血干细胞以及更多分化细胞类型，而第四个集落则缺乏表达造血干细胞标志物的细胞。通过将克隆细胞的子代进行过继移植，可评估各克隆在长期多谱系植入能力方面的表现，即随时间推移，供体细胞对受体外周血中髓系、B细胞和T细胞区室的贡献情况。

尽管大多数含有具有造血干细胞表型细胞的克隆能够实现长期植入，但仍需通过移植来确认其是否具有功能性多谱系植入能力，因为部分克隆会随着时间推移而失去植入能力。随后可将每个克隆的功能性造血干细胞潜能与其原始的索引分选参数进行关联，以确定其精确的表型特征。在此基础上，还可进一步采用其他方法，例如在支持B细胞和T细胞体外发育的基质上对造血子代进行二次培养，以探究单个造血前体细胞的淋巴细胞分化潜能。