人端粒酶逆转录酶蛋白依赖RNA的RNA聚合酶活性的半定量检测

该方法有助于解答RNA生物学领域中的关键问题，例如RdRP或TERT在人类细胞中的生物学意义是什么？该技术的主要优势在于，该检测方法是首个建立的可灵敏检测细胞中表达的人源RdRP活性的方法。按照文本方案中的描述，首先准备HeLa细胞，然后开始本实验操作。

用 10 毫升 PBS 清洗细胞一次。然后，在 4 摄氏度下以 1,450 ×g 离心 5 分钟，并弃去上清液。每 1,000 万细胞加入 1 毫升预冷的裂解缓冲液 A，通过轻柔吹打裂解细胞。

将样品置于1.5毫升离心管中，在超声破碎仪上以25%的振幅超声处理10秒。超声处理后，在4°C条件下以20,400 ×g离心15分钟。收集上清液，并将1毫升上清液分别转移至1.5毫升微量离心管中。

每毫升裂解液中加入40微升预先洗涤的Protein A-agarose珠进行预清除。通过反复倒置离心管充分混匀，然后在4°C下旋转孵育30分钟。

在4°C条件下，以13,000 × g离心样品1分钟，收集上清液。接着，向预清除的裂解液中加入40 µL预洗涤的Protein A-agarose微珠和10 µg抗人TERT抗体。通过反复倒置离心管充分混匀，并在4°C下旋转孵育过夜。

在4°C、3,300倍重力下离心30秒后，弃去上清液。接下来，用洗涤缓冲液一洗涤磁珠。向磁珠中加入1毫升洗涤缓冲液一，通过反复倒置试管充分混匀。

然后，在 4 °C 条件下旋转样品 5 分钟。在 4 °C 条件下以 3,300 ×g 离心 30 秒。弃去上清液，并重复此步骤额外三次。

按照文本方案中所述的 AGC 溶液洗涤步骤，通过轻轻吹打将珠子重悬于 60 微升微球菌核酸酶反应混合液中，以进行微球菌核酸酶处理。随后，将样品置于帕尔帖型孵育箱内的摇床转盘上，于 25 摄氏度轻轻振荡 15 分钟。在 4 摄氏度下以 3,300 ×g 离心 30 秒后，弃去上清液。

最后，用含有3毫摩尔EGTA的AGC溶液将珠子洗涤两次，并按照文本方案中的描述用洗涤缓冲液二洗涤一次。在新管中按照文本方案所述配制RdRP反应混合液。向反应混合液中加入6微升α磷酸基团标记有P-32的尿苷三磷酸，用移液器吹打充分混匀。

然后，向混合物中加入一微升的模板 RNA，并充分混匀。用 20 微升的 RdRP 反应混合物重悬磁珠。接下来，将样品置于帕尔帖式孵育箱中，在摇床的转盘上以 32 摄氏度轻轻振荡两小时。

孵育后，向反应混合物中加入5.4微升浓度为20毫克/毫升的蛋白酶K和45.4微升2倍浓度的蛋白酶K缓冲液。用移液器吹打混匀，并将样品置于Peltier型孵育器中，在37摄氏度下振荡30分钟。向样品中加入109.2微升无RNase的水后，再加入200微升酸性酚-氯仿。

在室温下以21,100 × g离心样品5分钟前，先通过涡旋充分混匀。将水相转移至新管中。重复此步骤一次。

然后，向水相中加入 20 µL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）、4 µL 沉淀载体和 250 µL 乙醇。充分振荡混匀试管。在 4 °C 条件下，以 21,100 ×g 离心 20 分钟，弃去上清液。

接下来，用300 µL预冷的、保存在-20 °C的70%（体积比）乙醇洗涤沉淀。在4 °C条件下，以21,100 ×g离心15分钟。弃去上清液，并将沉淀在空气中干燥。

将沉淀重悬于20微升无RNase的水中。按照文本方案所述，在新管中配制RNase反应混合液。向样品中加入180微升RNase反应混合液。

然后，将离心管在37摄氏度下孵育2小时。向样品中加入2.3微升10%（体积比体积）的SDS，并在37摄氏度下孵育15分钟。接着，向样品中加入2微升20毫克/毫升的蛋白酶K，并在37摄氏度下再孵育15分钟。

现在，向样品中加入205 µL酸性酚-氯仿。混匀后离心，操作同前，将水相转移至新管中。向水相中加入3 mol/L乙酸钠、沉淀载体和乙醇，随后混匀、离心，并按先前方法洗涤沉淀。

图中显示了经诺考达唑或DMSO处理的HeLa细胞以及未经处理的HeLa细胞中IP-RdRP实验的三个代表性结果。实验使用化学合成的34个核苷酸RNA作为模板。经过过夜曝光后，可在20至30个核苷酸之间检测到RdRP产物，且这些产物特异性地存在于处于有丝分裂期的HeLa细胞中。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何检测人端粒酶逆转录酶（TERT）的RdRP活性。