一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

本方案通过使用生物素标记的RNA寡核苷酸从细胞提取物中下拉已知RNA序列的蛋白结合伴侣，从而实现其鉴定。与需要使用去垢剂或高温条件将蛋白质从RNA上解离的方法相比，本方案采用极为温和的条件，能够同时保留潜在的蛋白质复合物。该实验操作将由我的博士生Jakob Rupert进行演示。

开始总蛋白提取：移除 HEK 293T 细胞培养板各孔中的培养基，用一毫升 PBS 清洗六孔板的各孔。弃去 PBS，将培养板置于冰上，然后向每孔中加入 200 微升裂解缓冲液。使用细胞刮刀刮下并破碎细胞，随后将来自两个孔的细胞提取物转移至同一个 1.5 毫升离心管中。

冰上孵育30分钟并离心后，将上清液转移至预冷的离心管中。接着，计算含有1.5毫克蛋白质的蛋白提取物体积。然后用裂解缓冲液将所有样品调整至终体积为600微升。

使用前将样品置于冰上。准备磁珠时，通过轻弹管壁使磁珠在保存缓冲液中混匀。根据每份样品100 µL浆液介质计算所需体积后，将相应体积的浆液加入磁力架中。

洗涤磁珠时，先移除保存溶液，然后加入一毫升裂解缓冲液，手动颠倒混匀。接着将磁珠置于磁力架上，移除缓冲液，并重复洗涤步骤一次。向磁珠中加入与初始浆液体积相等的裂解缓冲液，轻轻弹击离心管混匀，再将缓冲液均匀分装至与样本数量相同的1.5毫升离心管中。

进行珠子封闭时，使用磁力架去除缓冲液，加入600微升用裂解缓冲液配制的浓度为0.25毫克/毫升的酵母tRNA溶液。在旋转摇床上室温孵育1小时。加入600微升裂解缓冲液前，使用磁力架去除tRNA溶液，并通过手动混合进行洗涤。

重复洗涤步骤，并弃去缓冲液。对于每管含有初始100微升裂解液的样品，用600微升裂解缓冲液配制200微克RNA寡核苷酸。将寡核苷酸加入珠子中，在室温下旋转孵育1小时。

从珠子中移除溶液，再用600微升裂解缓冲液重悬珠子，室温下旋转孵育5分钟，洗涤两次。弃去上清液。为进行珠子上的蛋白结合实验，从600微升蛋白溶液中分出5%或30微升体积，作为输入样（input或IN），用于后续分析。

将剩余的蛋白质混合物加入每管已加载的磁珠中，在4°C下缓慢旋转孵育过夜。使用磁力架从磁珠中移除未结合的蛋白质组分。保留其体积的5%或30微升，并标记为流穿液（flow through）或FT。向磁珠中加入1毫升洗涤缓冲液1，在4°C下旋转5分钟。

弃去缓冲液，并重复此洗涤步骤一次。向珠子中加入1毫升洗涤缓冲液2，在4°C下旋转孵育5分钟，然后弃去上清液。

为洗脱特异性结合物，向珠子中加入100微升洗脱缓冲液1。轻轻弹动混匀后，在室温下孵育5分钟。将离心管置于温控混匀仪中，在95摄氏度下剧烈振荡5分钟。

然后将离心管放入磁力架中，收集洗脱组分至一支干净的离心管中。操作完成后，使用台式离心机快速离心磁珠，以最大程度回收洗脱液。并保留总洗脱液体积的5%或5微升（取两者中较大值）用于后续分析。

通过质谱法鉴定洗脱的蛋白质。将显著富集的蛋白质绘制在火山图中，结果显示，从RNA洗脱的总蛋白含量以及富集蛋白显著高于RNA，表明RNA能够形成更多的特异性相互作用。作为预测结果与实验结果一致性的示例，正链RNA和负链RNA与人类蛋白质组中蛋白质的相互作用评分显示，HNRNPH3被预测可选择性结合正链RNA，而PCBP2则被预测可特异性地与RNA相互作用。

此外，预测蛋白RBM41可同时与两种RNA寡核苷酸发生非特异性结合。蛋白质pull-down实验样品的质谱分析证实，HNRNPH3存在于RNA中，PCBP2存在于负链RNA中，而RBM41则被发现可与两者相互作用。

采用蛋白质印迹法检测结果及实验方案优化步骤中TDP-43的存在情况。在RNA实验中，TDP-43在上样样本和洗脱液中均被检测到，表明其自始即存在。在洗涤步骤中，TDP-43被RNA保留，并在最后通过高盐缓冲液洗脱出来。

通过绘制蛋白质与RNA的相互作用图谱，该方法能够揭示多种生理通路背后的生物大分子网络，例如转录调控或包括癌症和神经退行性疾病在内的病理机制。