TAGGG端粒长度检测法性能参数的优化

我们的研究范围包括测量不同研究组之间的端粒长度差异。我们试图回答的问题主要围绕生理状况相关疾病，以及这些疾病如何影响端粒长度，反之亦然。目前用于推动端粒长度生物学研究的技术包括纳米孔测序，以及近期发展的基于CRISPR-Cas的测量方法。

目前实验面临的挑战是准确测量端粒的绝对长度及其变化。同一份样本在使用不同的端粒长度测量方法时，可能会得到不同的结果。我们所要解决的研究空白在于缺乏一种标准化的端粒长度测量方法。

端粒限制性片段分析（TRF）仍是评估所有新技术的标准。此外，我们优化的实验流程有助于在资源有限的情况下处理更多样本。我们的研究结果将通过提供一种可靠且相对经济的方法来将新方法与TRF这一金标准进行比较，从而推动端粒长度生物学领域的研究进展。

我们的实验室将重点研究小分子抑制剂对端粒长度的影响。我们还将探讨生活方式疾病与端粒长度之间的相互作用。首先，向先前获得的 A2780 细胞沉淀中加入 500 µL 裂解缓冲液，并使用最小开口直径为 2 mm 的去尖枪头轻轻混匀。

加入终浓度为 20 µg/mL 的新鲜配制的 RNase A，通过轻柔颠倒混匀。在 37 °C 下孵育 30 分钟。孵育结束后，加入蛋白酶 K 至终浓度为 100 µg/mL，并轻轻颠倒 10 次。

再次于 55 摄氏度孵育一小时，每 10 分钟倒置离心管一次。用移液器将 500 微升漏斗状氯仿异戊醇试剂加入离心管中，轻轻倒置离心管约 20 次。于室温下以 9,391 ×g 离心 15 分钟。

用移液器将上层水相黏稠层转移至新离心管中。加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀。离心一次后，收集水相层。

加入适量的5摩尔氯化钠至离心管中，使浓度增加0.2摩尔。向管中加入两倍体积的100%乙醇，并轻轻颠倒混匀20次。在室温下以15,871 ×g离心5分钟。

弃去上清液后，加入 500 微升 70% 乙醇。在相同条件下再次离心，然后弃去上清液。待沉淀物空气干燥后，加入 50 微升无菌无核酸酶水，使其重新水合。

然后使用剪去末端的吸头通过移液操作混匀DNA。采用紫外分光光度法测定DNA的浓度。DNA消化完成后，使用0.8%琼脂糖凝胶进行分离。

将琼脂糖凝胶浸入0.25摩尔盐酸溶液中，在室温下轻轻振荡10分钟。然后用蒸馏水冲洗凝胶两次。为使DNA变性，将凝胶浸入氢氧化钠和氯化钠溶液中。

然后，用蒸馏水冲洗凝胶两次。为中和DNA，如图所示，将凝胶浸入pH为7、含有0.5摩尔盐酸和3摩尔氯化钠的溶液中。提取的基因组DNA显示出良好的完整性，表明其可用于后续端粒限制性片段的加工处理。

进行Southern印迹杂交时，首先将尼龙膜裁剪成10厘米×12厘米大小的片段。在与凝胶相同的位置上剪出一个缺口。通过将膜浸入蒸馏水中，随后浸入20×SSC缓冲液中，以活化膜。

将滤纸灯芯置于双层倒置托盘上，使其两端接触外层托盘的底部。将凝胶放置在滤纸上方。

然后将活化的尼龙膜覆盖在凝胶上，确保切口位置对齐。用玻璃棒去除所有气泡。放置一堆高度为2厘米、尺寸为9.5 × 11.5厘米的纤维素滤纸，以及另一堆高度为6厘米的普通滤纸。

在装置上方放置一个重物以确保重量均匀分布。在外层托盘中加入20×柠檬酸钠缓冲液（SSC），并过夜孵育以实现高效转印。Southern转印后，使用紫外透射仪通过紫外交联将转印至膜上的DNA固定。

用25毫升2× SSC缓冲液洗涤膜两次。进行杂交时，将膜置于10毫升预热的预杂交缓冲液中孵育，并在孵育过程中频繁手动轻轻振荡膜。

然后，将印迹膜置于10毫升杂交缓冲液中，在42摄氏度下轻轻振荡孵育3小时。用25毫升严格洗涤缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤印迹膜两次，每次10分钟。接着，用25毫升预热至50摄氏度的严格洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤印迹膜两次，每次15分钟。

用 15 毫升洗涤缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。将膜置于 10 毫升新鲜配制的封闭液中，在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。然后将其放入含有碱性磷酸酶标记的抗地高辛工作溶液 10 毫升中。

在室温下用洗涤缓冲液洗涤印迹膜两次，每次15分钟。随后在10毫升检测缓冲液中室温孵育5分钟。去除多余缓冲液后，将膜放置在醋酸纤维素膜上，DNA面朝上。

将约1至1.5毫升底物溶液逐滴加至膜上。立即在膜上覆盖另一张醋酸纤维片，于室温孵育5分钟。成像前挤出多余的底物溶液。

使用凝胶成像系统，在不同时间点采集多个未饱和的图像用于分析。在进行Southern印迹和杂交后，端粒限制性片段清晰可见，表现为一条弥散条带。