人源肺组织精准切割切片中物质细胞毒性和免疫调节效应的评估

建立人源性精准切割肺组织三维模型的总体目标是利用人体组织在离体模型中评估细胞毒性及免疫调节效应。该方法有助于回答药理学与毒理学领域中的关键问题，从而评估物质的安全性，并在原生人体环境中评价其生理反应。该技术的主要优势在于，通过使用新鲜且具有活性的人体组织，能够有效模拟人类呼吸系统疾病中的细胞毒性或免疫调节效应。

尽管该方法可为人类细胞间相互作用、生理学及呼吸系统疾病的发病机制提供深入见解，但它也可应用于其他领域及其他物种。通常，初次接触该方法的研究人员在组织评估人体组织和建立可靠的技术体系方面会遇到困难。此外，由于肺组织具有高度异质性，灌注过程需要大量的训练和实践经验。

开始此操作时，通过插入硅胶管并用夹子将其固定，以实现气管插管，夹子应与硅胶管平行放置，使夹子将组织与硅胶管一起夹紧，但不压闭管腔。用夹子封闭所有其他支气管、血管及损伤部位，以防止在灌注过程中琼脂糖泄漏。插管主支气管需要良好的解剖操作技能。

肺组织不应过度扩张，否则组织会撕裂；如果灌注不充分，组织会过于柔软，无法制备任何PCLS。然后，在烧杯中将等体积的3%低熔点琼脂糖与培养基混合。使用15毫升注射器将混合液注入肺组织中。

在用培养基重新填充注射器之前，用手指或夹子夹紧导管，以避免产生气泡和琼脂糖回流。将肺组织切成3至5厘米厚的片状。向组织切片机中加入400毫升冰冻的EBSS。

使用半自动螺丝刀配合取芯工具，立即从肺组织切片中切割出圆柱形组织芯。随后，将组织芯转移至组织切片机的组织固定架中。将重物置于组织芯上方，开始将组织芯切片制成PCLS（肺切片组织培养物）。

打开玻璃圆筒的夹子，将组织切片仪中的培养基排入烧杯中。接着，将切片从烧杯转移至含有培养基的培养皿中。随后，将培养皿放入培养箱，使培养基在洗涤步骤前预热。

然后，将肺组织切片小心转移至24孔培养板中，每孔加入至少500微升培养基，每孔放置两片组织切片。为配制工作液的主混合液，需为每孔加入25微升WST-1试剂和225微升培养基。接着，每孔加入250微升WST-1主混合工作液，并将培养板在37摄氏度下孵育1小时。

确保在孵育过程中PCLS完全被WST-1试剂覆盖。随后，将培养板置于200 RPM的轨道摇床上，轻轻振荡30秒，以确保WST-1试剂充分混匀。然后，用移液器将24孔板中每孔的上清液各100微升，重复取样至新的平底96孔板中。

使用酶标仪在450纳米处测定各孔的吸光度，并从450纳米处的吸光度中减去630纳米处的参考吸光度。将PCLS与测试试剂孵育后，将50微升上清液以复孔形式转移至新的96孔板中。由此可从24孔板的每个处理孔中获得复孔样本。

在进行检测前，立即配制无LDH试剂的工作液主混合液：将125微升催化剂溶液与6.25毫升染料溶液充分混合，用于96孔板。然后，将50微升主混合工作液加入各已含有50微升上清液的孔中。将板在室温下避光孵育20分钟。

随后，使用酶标仪在492纳米处测定每个孔的吸光度，并从492纳米处的吸光度中减去630纳米处的参考吸光度。对于显微观察，使用共聚焦激光扫描显微镜（cLSM）至少采集两个随机分布的Z轴层扫图像。单击目镜选项卡，选择10倍物镜。

单击“Online”以将cLSM用作标准光学显微镜，找到PCLS的表面。然后，单击“Offline”退出目镜设置。随后，点击“Acquisition”选项卡，并为相应的荧光染料开启适当的激光器。

在采集选项卡下点击光路，为实验设置必要的滤光片和反射镜。按下实时按钮，可在屏幕上查看相应层的实时图像。上下调节焦距，直至肺切片表面呈现清晰的信号。

随后，将红色碘化丙啶同型二聚体-1通道的针孔设为一个空气单位，以在光收集效率和光学切片效果之间达到最佳平衡，并相应调整钙黄绿素通道。提高增益以增强检测信号。增加或减少数字偏移，以调节背景，使其在激活通道颜色锁定表的活体图像中呈现蓝色。

勾选Z轴堆叠复选框以设置显微体积的上限和下限。缓慢上下调节焦距，直至达到30微米的范围，然后按“设置终点”以保存。接着，再次单击“实时”以关闭实时图像，再按“开始实验”以启动成像。

图中显示的是PCLS的显微存活率图像，展示了人体组织对洗涤剂作为有效毒性物质的反应性。通过评估钙黄绿素阳性组织与碘化乙啶同源二聚体-1阳性细胞核的对比，可直观判断毒性效应。尽管人体肺组织的存活率在不同供体之间存在差异，但与存活组织相比，死亡细胞核的数量不应超过组织对照的15%。

该图展示了六氯铂酸铵（一种SLS）对人肺组织免疫调节作用的代表性数据。通过ELISA法测定细胞外和细胞内的IL-1α和TNF-α，并将其归一化至总蛋白含量。该技术建立后，为药理学和基础科学领域的研究人员探索活性人肺组织内的生理反应开辟了道路。

完成此操作后，还可进行其他终点检测，例如气道收缩，以回答更多问题，如支气管扩张药物的有效性。观看本视频后，您应能够较好地掌握如何制备和处理人源性精准切割肺组织片。一旦熟练掌握，该技术可在六至八小时内完成，若操作得当，最早可在24小时内获得初步结果。

然而，请务必注意，处理未固定的**人类**材料可能具有极其严重的感染风险，因此在进行此操作时，应始终穿戴防护服等防护装备。此外，必须牢记尽可能在无菌条件下操作。