一种从小鼠中同时分离原代胰岛和原代胰腺腺泡细胞的简便快速方法

本研究建立了一种简化方法，可高效提取小鼠胰腺中的功能性原代胰岛及腺泡细胞，为研究急性胰腺炎诱导糖尿病（PPDMA）发病机制中的细胞内通讯提供了有力工具。目前从小鼠分离原代胰岛的主要方法依赖于胆管插管技术。该技术需要精确定位并插管胆管，随后进行胰腺实质的体内灌注胶原酶P溶液。

若无专业培训，很难完成有效的胰腺灌注，实现高效灌注具有挑战性。本视频介绍了一种简单快速的原代胰岛分离方法，适用于无灌注经验的研究人员。该方法还可同时获取原代胰腺腺泡细胞，能够获得足量且高质量的胰岛和腺泡细胞。

该方法使研究人员能够在相同的病理和生理背景下进行实验，从而促进对胰岛细胞与腺泡细胞之间相互作用机制的深入分析。胰岛细胞和胰腺腺泡细胞（PACs）的分离。向12孔板中加入Hank's平衡盐溶液和胶原酶P溶液，并向50毫升离心管中加入3毫升胶原酶P溶液，用于后续消化。

手术前用1.25%三溴乙醇麻醉小鼠，随后实施安乐死。作V形腹部切口以打开小鼠腹腔。位于左季肋区的暗红色淋巴器官为脾脏，附着于脾脏的白色器官为胰腺。

沿胃下缘及胰十二指肠交界处仔细进行钝性分离胰腺。用Hank's平衡盐溶液清洗分离的胰腺组织，去除残留的肠系膜附着物、脾脏及胰周脂肪组织。将预处理后的胰腺转移至已预先加入2 mL胶原酶P溶液的12孔板中。

用左手持镊子固定胰腺，右手持1 mL注射器将胶原酶P溶液注入胰腺实质，直至胰腺组织呈现半透明和水肿状。用手术剪迅速将胰腺切成1至2 mm³的组织块。剪去1 mL移液器吸头末端1至1.5 cm，以扩大开口，用此改造后的吸头将胰腺组织块连同2 mL胶原酶P溶液一起转移至预先加入3 mL胶原酶P溶液的50 mL离心管中。

将离心管置于37摄氏度水浴中孵育12分钟，期间每5至6分钟轻轻振荡试管一次。加入10毫升RPMI 1640完全培养基，以终止胶原酶P溶液的消化作用。用5毫升巴斯德移液管反复吹打沉淀物，上下吹打15至20次，直至无明显的大块组织残留。

加入10毫升RPMI 1640完全培养基。然后在4摄氏度下以180 × g离心2分钟，弃去上清液，用20毫升RPMI 1640完全培养基重悬沉淀。

将悬液通过40目筛网过滤，然后在4°C条件下以180 × g离心2分钟，小心弃去上清液。

加入20毫升Ficoll溶液以重悬沉淀。然后缓慢加入15毫升RPMI 1640完全培养基。此时可观察到清晰的液体界面。

在25°C下以640 × g轻轻离心20分钟。小心取出离心管，使用5 mL巴斯德吸管吸除上层红色培养基。然后，小心吸取液体层界面处含有胰岛的液体，并转移至新的50 mL离心管中。

加入20毫升RPMI 1640完全培养基。在4°C下以180 × g离心2分钟，弃去上清液。用20毫升RPMI 1640完全培养基重悬沉淀。

在4°C条件下，以180 × g离心2分钟，弃去上清液。用10 mL RPMI 1640完全培养基重悬沉淀，并转移至60 mm细胞培养皿中。

在倒置生物显微镜下以100倍放大倍数，使用20微升移液器手动挑选胰岛。将选好的胰岛转移至已预先加入500微升RPMI 1640完全培养基的24孔细胞培养板中。弃去Ficoll溶液层。

用10毫升完全DMEM培养基重悬沉淀。通过100微米细胞滤网过滤。在4摄氏度下以180 × g离心2分钟。

弃去上清液。用10毫升完全DMEM培养基重悬沉淀。在4°C下以180 × g离心2分钟，并弃去上清液。

然后，用5 mL DMEM完全培养基重悬沉淀，用于后续实验。经过Ficoll溶液密度梯度离心后，胰岛可见于透明无色液体层与管底含有沉淀物的培养基之间的界面附近。胰岛通常呈圆形或椭圆形，金棕色，每只小鼠的稳定产量为120 ± 5个，见图A和图B。 freshly isolated PACs呈球形并成簇聚集。

腺泡细胞的顶端较深，可见明显的酶原颗粒，每只小鼠的细胞产量为 1.6 至 1.95 × 10⁷ 个细胞，见图 C 和图 D。胰岛和腺泡细胞的钙黄绿素-PI 染色显示，大多数细胞呈绿色钙黄绿素荧光（活细胞），仅有少量呈红色 PI 荧光（死细胞），见图 A。基于 Image J 的定量分析显示，分离得到的胰岛和腺泡细胞的存活率分别为 97.52 ± 0.16% 和 96.55 ± 0.95%，见图 B。分离的胰腺腺泡细胞的基础淀粉酶活性为 0.79 ± 0.01 单位/毫升。在分别用 10 纳摩尔、20 纳摩尔和 50 纳摩尔雨蛙素刺激后，其淀粉酶活性分别为 1.45 ± 0.03 单位/毫升、1.65 ± 0.05 单位/毫升和 1.39 ± 0.02 单位/毫升。单因素方差分析显示，所有雨蛙素处理组与对照组相比，淀粉酶活性均有显著差异，所有 P 值均小于 0.001。

此外，20 纳摩尔组与 10 纳摩尔组之间差异显著，P 值小于 0.001，图 A。分离的胰岛在 5.6 毫摩尔葡萄糖刺激下胰岛素分泌量为 0.27 ± 0.04 纳克/毫升/胰岛/小时，在 22 毫摩尔葡萄糖刺激下为 0.94 ± 0.04 纳克/毫升/胰岛/小时，GSI 等于 3.44，图 B。本研究建立了一种无需复杂体内灌注的原代小鼠胰岛和胰腺腺泡细胞同步分离方法。尽管该技术存在较长的技术壁垒，但操作简便，每只小鼠可获得 120 ± 5 个胰岛和 1.6 至 1.95 × 10⁷ 个腺泡细胞，两类细胞的存活率均超过 96%。分离得到的胰岛表现出正常的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能，腺泡细胞对蛙皮素（caerulein）刺激具有敏感性。这证实了通过该方法获得的细胞功能完整，适用于胰腺外分泌与内分泌相互作用的研究。

尽管该方法受限于需要具备基本的小鼠解剖学知识、需调整试剂剂量、同时处理的小鼠数量有限，以及存在未经验证的应用风险，但对于缺乏灌注经验的研究人员而言，它仍提供了一种可靠的细胞分离方案。