高分辨率呼吸测定法测量天然化合物存在下完整β细胞的线粒体功能

本方法的总体目标是在胰岛素刺激条件下，直接评估胰腺β细胞的呼吸功能。该方法还可用于观察不同化合物对β细胞呼吸功能的影响。此技术有助于解答胰腺β细胞生理学领域中的关键问题，例如某种特定化合物是否通过改变呼吸作用来影响胰腺β细胞的功能。

该技术的主要优势在于，可在基础状态和胰岛素刺激条件下，直接评估胰腺β细胞的呼吸功能。由于细胞制备和呼吸测定过程需要高度精确，细胞制备和仪器操作步骤较难掌握，因此对该方法进行可视化演示至关重要。首先，在添加补充物的RPMI 1640培养基中培养源自INS-1的832/13 β细胞。

从T75培养瓶中去除细胞，加入两毫升0.25%胰蛋白酶，在37摄氏度孵育10分钟。然后加入八毫升完全RPMI 1640培养基以中和胰蛋白酶。取100微升细胞悬液与900微升PBS稀释，使用血细胞计数板对细胞进行计数。

然后，以每毫升一百万个细胞的密度将细胞接种到10厘米的培养皿中。在开始呼吸实验前，将细胞置于37摄氏度、5%CO2的湿化培养箱中进行培养。接种后24小时更换培养基，并将832/13细胞继续在37摄氏度、5%CO2的湿化培养箱中培养。

然后，用溶剂对照或可可来源的表儿茶素单体处理细胞，使其终浓度为 100 纳摩尔。处理后，在 37 摄氏度、5% CO2 的湿润培养箱中继续培养 24 小时。随后，用 1× 低葡萄糖分泌检测缓冲液（SAB）洗涤细胞 5 分钟。

吸去缓冲液，将细胞在1×低糖SAB中孵育3小时，每小时更换一次缓冲液。孵育结束后，用1毫升0.25%胰蛋白酶将细胞从培养皿中消化下来。将经溶剂对照处理的培养皿中的胰蛋白酶消化细胞与4毫升SAB混合，转入15毫升锥形管中。

同样，将用目标化合物处理的培养皿与缓冲液混合。取100微升细胞悬液加入900微升磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释，使用血细胞计数板对细胞进行计数。取100微升细胞悬液加入900微升磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释，使用血细胞计数板对细胞进行计数。

数据表明，每毫升一百万个细胞的浓度最为有效。按照文本方案中的说明准备好高分辨率呼吸测定仪后，向每个氧电极室加入2.4毫升1×低葡萄糖SAB缓冲液。使用室内的磁力搅拌子在37摄氏度下以750转/分钟持续搅拌缓冲液，数据记录间隔为2.0秒。

为此，请选择 F7 按钮，打开标有“systems”的选项卡。将推杆完全推入，然后回撤至扳手通气设置位置。让仪器至少平衡一小时，直至获得稳定的氧气通量。

接下来，在整个实验过程中将仪器温度设置为 37 摄氏度。按下 F7 按钮，打开标有“氧气 O2”的选项卡，将极化电压设为 800 毫伏，增益设为 2。用 SAB 缓冲液平衡氧气浓度至少 30 分钟，直至氧气浓度变化趋于稳定。

然后，按住 Shift 键，用鼠标左键单击并拖动，选择一个氧浓度变化稳定的区域，以建立氧浓度变化的背景测量。单击与所选区域对应的字母，并将每条曲线中对应两个腔室的区域标记均更改为 R1。双击屏幕左下角和右下角的 O2 校准框。

点击空气校准的“选择标记”按钮作为 R1，然后对两个腔室均选择“校准并复制到剪贴板”。接下来，在每个腔室中加入 2.4 毫升样品，一个腔室加入经对照载体处理的细胞，另一个腔室加入经化合物处理的细胞，均使用 1x 低葡萄糖 SAB。将推杆完全推入，并吸出残留体积。

在后续所有步骤中，整个实验过程中以 750 rpm 和 37 摄氏度持续搅拌细胞。当样品加载后，点击 F4 进行标记，并将该标记标注为“cells”。测量样品 30 分钟。

信号稳定后，选择与低葡萄糖条件相对应的氧浓度变化区域。然后，使用注射器通过钛加载口向每个腔室加入12.5微升45%的无菌葡萄糖溶液。在添加处理剂时，标记为“葡萄糖”。

让信号稳定，并记录细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量。此时，选择氧浓度变化的区域，以代表16.7毫摩尔葡萄糖读数，该读数对应于刺激条件。信号稳定后，通过加样孔向每个腔室加入一微升五毫摩尔寡霉素A。

添加处理时，标记为“OligoA”。待信号稳定后，记录细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量。一旦达到稳定的氧通量，选择曲线的这一区域。

寡霉素A可抑制ATP合酶，因此此时发生的唯一氧通量来源于电子泄漏，而非氧化磷酸化。接下来，以每微升1微摩尔的FCCP逐步添加，直至达到最大呼吸速率。此值代表最大非耦联呼吸。

加入三到四微升FCCP足以诱导INS-1衍生的832/13胰岛β细胞达到最大解偶联呼吸。在添加处理剂时标记为“FCCP”。待信号稳定后，持续记录细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量。

然后，选择该曲线区域。FCCP 是一种解偶联剂，可用于测量解偶联呼吸。待信号稳定后，通过加样孔向每个腔室加入一微升五毫摩尔的抗霉素 A。

添加处理时标记为“AntiA”，并重复曲线选择步骤。通过呼吸仪分析程序的 F3 按钮输入检测中使用的每毫升细胞数量。将单位更改为每毫升细胞数，输入细胞浓度，并将培养基更改为 SAB。

通过在氧气校准表单中选择并输入背景读数来标准化数据。选择以下条件下的读数：2.5 毫摩尔葡萄糖、16.7 毫摩尔葡萄糖、寡霉素 A、FCCP 和抗霉素 A。在呼吸测定分析程序中，输入蛋白浓度，并在呼吸测量期间为每种处理选择相应的平均值。然后，点击 F2 键，并点击复制到剪贴板功能。

此操作可将数据导出，用于其他分析程序。计算时应使用O2斜率的负值。整合3至5次独立实验的数据，包括溶剂处理的对照组和天然化合物处理的细胞组，以评估其对INS-1衍生的832/13胰岛β细胞完整细胞呼吸作用的影响。

完整的由INS-1衍生的832/13 β细胞表现出葡萄糖诱导的氧利用增加。使用适当数量的细胞至关重要。本实验获得的结果表明，每毫升一百万个细胞为最佳数量。

经姜黄素处理的INS-1衍生832/13 β细胞总体呼吸无变化。相反，经单体可可表儿茶素处理的INS-1衍生832/13 β细胞在2.5毫摩尔/升葡萄糖和16.7毫摩尔/升葡萄糖条件下呼吸增加。在泄漏状态（即基础非磷酸化呼吸状态）以及电子传递系统呼吸（ETS状态，即最大呼吸）期间，也观察到呼吸增加。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在胰岛素刺激条件下直接评估胰腺β细胞的呼吸功能。一旦掌握该技术，若操作得当，可在五小时内完成。在进行该实验时，务必记住需先用低葡萄糖SAB缓冲液预处理细胞，并对检测所用细胞进行准确计数。

通常，初次使用该方法的研究者在获取适量细胞以进行有效测量方面会遇到困难。细胞数量过多时，信号难以评估；而细胞数量过少时，信号强度又不足以进行稳定测量。该技术的应用意义延伸至糖尿病及所有受胰腺β细胞功能变化影响的疾病的治疗或诊断，因为线粒体呼吸是胰岛素分泌机制中的关键环节。

在完成该实验步骤后，还可进行其他方法，例如葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验，以回答更多问题，比如：这些化合物对胰岛素分泌有何影响？尽管该方法可用于研究β细胞功能，也可应用于其他系统，如肌肉、肝脏、脂肪组织以及其他线粒体呼吸功能分析。