通过高分辨率呼吸测定法评估坐骨神经中的线粒体功能

本方案通过分离线粒体并对其进行分段分析，实现了在含有有限数量线粒体的小型组织——神经内部评估线粒体功能，该操作在此类组织中具有较高难度。该技术能够在原位保持线粒体结构完整的基础上，同时分析其功能，如耗氧量和活性氧（ROS）的产生。通过使用多种底物、抑制剂和解偶联剂，可设计相应的实验方案。

多种疾病均涉及线粒体功能障碍，特别是由2型糖尿病或化疗引起的神经病变。在这些疾病中，线粒体氧化磷酸化功能受损是决定疾病发展的唯一指征。该方法有助于深入理解神经生物学、生物化学和药理学，可用于研究线粒体疾病的发病机制，并探索治疗策略，例如增强线粒体功能的药物或改善神经病理性疼痛的疗法。

首先，通过移液将 2.1 毫升 MR 缓冲液加入每个腔室中，校准氧气传感器。用密封塞封闭腔室，并吸入空气直至形成气泡。在 37 摄氏度下以校准模式搅拌一小时，直至单位质量的氧气通量稳定。

根据制造商的说明，使用 HRR 软件对极谱式氧传感器进行空气校准。进行组织制备时，将坐骨神经置于含有足够 TP 缓冲液以浸没组织的培养皿中。用一把镊子夹住神经的一端，再用另一把镊子将神经束水平拉出。

首先，将显示的组织转移至含有1毫升TP缓冲液的小型培养皿中，以进行组织通透处理。开始通透时，用镊子将组织转移至另一含有1毫升TP缓冲液（含50微克/毫升皂苷）的培养皿中。将培养皿置于微量板摇床中，轻轻振荡30分钟。

然后，用镊子将组织转移至含有1毫升MR缓冲液的新培养皿中，轻轻搅拌10分钟。再用镊子将组织转移至已校准的HRR chamber中。向HRR chamber中加入2.1毫升MR缓冲液。

加入Amplex Red和过氧化物酶，使其终浓度分别为5 µM和2单位/毫升。然后，加入可渗透的坐骨神经。连接仪器的荧光传感器。

然后，在软件的控制部分关闭灯光，并点击连接氧合图仪。在软件中进入“编辑方案”并输入组织重量。进入布局界面，选择“单位样品的特异性通量”选项。然后选择绘图，以同时获取氧气消耗读数，如有需要，还可获取过氧化氢生成量。

等待约10分钟。注入两份过氧化氢，每份使其终浓度为260微摩尔，以校准反应室。加入20微升琥珀酸盐（线粒体复合体II底物），以激活线粒体电子传递系统。

加入 20 微升 ADP 以激活 ATP 合成。随后加入 5 微升细胞色素 c，作为膜完整性的指示剂。用 0.2 微克/毫升的寡霉素分次滴定，直至观察不到氧气消耗的进一步下降为止。

以每份0.5微摩尔/升的FCCP（线粒体解偶联剂）进行滴定，直至氧消耗量不再进一步增加。实验结束时，加入2微升抗霉素A，使其终浓度为5毫摩尔/升，并等待流速稳定。转至命令栏。

在软件中搜索“多感官”。点击“控制”，然后按“保存文件”并断开连接。打开保存的文件，选择按质量托盘计算的氧气通量，以获得实验中的氧气消耗结果。

通过按住 Shift 键并单击鼠标左键，手动选择两次加样之间的窗口。转到“标记”（marks），选择“统计”（statistics），以显示底物、抑制剂和解偶联剂加样过程中每次加样的结果。对于过氧化氢生成量的分析，使用安培斜率（amp slope）曲线执行相同的操作。

ATP合酶活性促进的膜电位降低加速了氧气消耗。外源细胞色素C的加入仅引起呼吸作用的轻微刺激，证实了该制备样品线粒体外膜的完整性。记录了绝对氧通量，呼吸作用仅增加了6.3%，表明组织制备质量良好。

在提供电子传递系统燃料的不同底物存在下，同时测量了氧气消耗和活性氧（ROS）的产生。加入丙酮酸和苹果酸以作用于线粒体复合物I，可增加呼吸作用；进一步加入琥珀酸以作用于复合物II，也可增加氧气消耗。

因此可测试其他底物。活性氧的产生也有所增加，表明电子传递系统中存在氧气泄漏。加入饱和浓度的二磷酸腺苷可促进氧气消耗，驱动ATP的生成，并减少活性氧的产生。

相比之下，寡霉素滴定降低了氧气消耗并增加了活性氧（ROS）的产生。这表明透化的坐骨神经能够重现线粒体生理学中的标准关系。加入FCCP和鱼藤酮后，氧气通量的变化符合预期，证实了透化坐骨神经中线粒体生理功能和生物能量谱得以保持。

最重要的步骤是轻柔地制备组织切片，并确保所有腔室开口均被彻底清洁。线粒体功能的改变可能是由于功能障碍或线粒体数量减少所致。因此，建议通过PCR检测ATP合酶活性及线粒体DNA含量以进行确认。