高效复性和纯化趋化受体配体结合域的方法

本实验的总体目标是从包涵体中复性一种化学感受器配体结合域，并对其进行纯化，以用于结构与功能研究。为了确定细菌化学感受器传递何种信号及其机制，可利用分离的配体结合域对小分子文库进行筛选，或测定其在有无配体时的结构。在大肠杆菌（E.coli）中表达胞外配体结合域时，常导致其沉积于包涵体中。

在此，我们展示了如何从包涵体中回收毫克量级的功能蛋白。首先，取150 mL含有50 µg/mL氨苄青霉素的无菌LB液体培养基，接种已转化pET151 D-TOPO载体以表达六组氨酸标记TIp3-LBD的BL21-CodonPlus RIPL细胞。将培养物在37 °C、200 RPM条件下过夜培养。

准备六个2L的锥形瓶，每瓶中含有800 mL无菌LB液体培养基和50 µg/mL氨苄青霉素。每个锥形瓶接种20 mL过夜培养物。在37 °C下以200 rpm持续振荡培养，直至OD600达到0.6。

此时，通过向每个锥形瓶中加入 1 毫摩尔的 IPTG 来诱导蛋白表达。继续在 37 摄氏度、200 转/分钟的摇床中培养锥形瓶额外 4 小时。在 4 摄氏度下以 5000 ×g 离心 15 分钟，收集细胞。

然后，弃去上清液。将所有细胞沉淀转移至250 mL烧杯中，并加入100 mL缓冲液A。如果细胞是冷冻的，需待其完全解冻后再重悬沉淀。除非另有说明，否则样品应保持在冰上。

接下来，将重悬的细胞通过高压均质器处理三次，以裂解细胞并充分剪切基因组DNA。然后，在4°C条件下以10,000 ×g离心15分钟。收集1 mL上清液样品，于-20°C保存，用于后续的SDS-PAGE分析。

然后，弃去其余上清液，将沉淀置于冰上。接着，用 20 mL 冰冷的缓冲液 B 充分重悬包涵体沉淀。这有助于膜及膜蛋白的溶解。涡旋振荡样品 1 至 2 分钟以促进重悬。

离心样品后，先用涡旋振荡器振荡1至2分钟，将沉淀物在20 mL预冷的缓冲液B中充分重悬。确保沉淀物被分散成小块，然后通过移液器反复吹打样品使其完全重悬。

将样品按前述方法离心，并弃去上清液。如果上清液浑浊或带有颜色，需再次离心样品，并使用额外的冰冻缓冲液B重新悬浮沉淀。重复离心和重悬步骤，直至上清液澄清无色，再进行一次沉淀。

向沉淀中加入 20 mL 冰冷的缓冲液 C，通过涡旋振荡管子 1 至 2 分钟使沉淀重悬。然后离心样品后，加入 25 mL 冰冷的变性缓冲液 D。继续涡旋振荡管子 1 至 2 分钟，或直至包涵体沉淀被分散成小颗粒，充分重悬包涵体沉淀。将悬浮液在 4 °C、30 RPM 条件下轴向旋转混合 30 至 120 分钟。

将变性蛋白溶液在 30,000 ×g 及 4 °C 条件下离心 30 分钟，以澄清溶液。然后将上清液置于冰上，弃去沉淀。在以 500 RPM 搅拌 250 mL 缓冲液 E 的同时，加入含有六组氨酸标签 TIp3-LBD 的 60 毫克变性蛋白混合物。

将复性混合物在4°C、500转/分钟持续搅拌条件下孵育24至48小时。最终蛋白浓度为0.2 mg/mL。根据文本方案准备好7 L预冷的缓冲液A和透析袋后，使用透析袋夹封闭透析膜一端，并将透析混合物转移至透析袋中。

然后，夹紧透析管的开口端，并确保无泄漏。将透析管放入装有预冷缓冲液A的透析桶中。加入磁力搅拌子，确保搅拌过程中不会触碰透析管。在4°C条件下持续搅拌（500 RPM）透析样品，并在12小时内至少更换缓冲液四次。

最后一次更换缓冲液后，将样品置于透析袋中过夜透析。次日早晨，从透析桶中取出透析管，并将其内容物转移至500 mL烧杯中。除非另有说明，蛋白溶液需始终保持在冰上。

将蛋白溶液通过孔径为0.43微米的滤膜过滤至500 mL玻璃瓶中，以去除任何沉淀的蛋白质。根据文本方案完成螯合柱的洗涤、上样和平衡后，通过加入25 mL 5 M氯化钠、2.5 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）和2.5 mL 2 M咪唑储备液，将获得的复性蛋白样品调节至缓冲液F的组成。以每分钟5 mL或更低的流速将样品上样至柱中，并弃去含有未结合蛋白的穿流液。

然后，用 50 至 100 mL 的缓冲液 F 洗脱柱子，以去除非特异性结合的蛋白质，并弃去穿流液。用 25 mL 缓冲液 G 洗脱六组氨酸标签的 TIp3-LBD。随后，收集含有目标蛋白的穿流组分。根据文本方案配制缓冲液 H 并准备透析管后，将带有六组氨酸标签的 TEV 蛋白酶加入透析管中的六组氨酸标签蛋白溶液中。

加入终浓度摩尔比为1个TEV蛋白酶对8个目标蛋白的比例。将夹紧的透析管放入预冷的4 L Buffer H中，在4摄氏度下持续搅拌孵育2小时。随后更换缓冲液，继续透析过夜，以完成TEV介导的切割反应。

将蛋白溶液置换至缓冲液I，过滤蛋白溶液并再次调整样品后，将样品上样至预先准备的5 mL HiTrap Chelating HP柱。以5 mL/min的流速收集穿流液，其中含有未带标签的TIp3-LBD。对于已切割的蛋白，被切割下来的六组氨酸标签以及带有六组氨酸标签的TEV蛋白会保留在柱上。

使用 5 mL 缓冲液 F 洗涤层析柱，使未标记的蛋白质流穿，并收集流出液。然后，根据文本方案中的步骤平衡尺寸排阻层析柱，并对蛋白质样品进行浓缩和澄清，随后将样品上样至预先平衡的 26/60 凝胶过滤层析柱。以每分钟 4 mL 的流速加入缓冲液 A，并监测紫外吸收曲线以观察蛋白质的洗脱情况。

TIp3-LBD 的洗脱体积为 210 至 220 mL。最后，在层析完成后合并洗脱组分，测定蛋白浓度并进行 SDS-PAGE 分析。本视频展示的蛋白纯化流程每升细菌培养物可获得 10 至 20 mg 纯化的无标签 TIp3-LBD 蛋白。

如图所示，从凝胶过滤柱洗脱的蛋白质呈现单一且对称的峰，对应的洗脱体积为 220 mL，计算分子量为 29 kDa。SDS-PAGE 结果显示，包涵体中主要含有六组氨酸标签的 TIp3-LBD，其表观分子量为 28 kDa，接近根据氨基酸序列计算得到的 31.8 kDa。经过六组氨酸标签切除、亲和层析和凝胶过滤等步骤后，获得了高纯度的蛋白质。

使用CDSSTR进行的CD光谱分析显示，六组氨酸TIp3-LBD的二级结构由31%的α-螺旋和23%的β-折叠组成。这些数值也接近通过JPred 3服务器进行序列分析所预测的37%和26%。该实验方案从开始到结束至少需要五天时间，并可在三个不同阶段根据需要暂停。

在进行该实验操作时，必须注意：通过涡旋振荡或反复吹打，使包涵体在变性缓冲液中充分且完全地重悬，对于整个实验的成功至关重要。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对趋化受体TIp3的配体结合域进行复性和纯化。所获得的纯化蛋白可用于配体结合实验，以研究该受体对不同配体的特异性。

此外，我们先前已证明，通过该方法获得的蛋白质可用于形成高度有序的晶体，从而为研究其配体特异性的结构基础铺平了道路。该方法可能普遍适用于以可结晶且可溶的形式大量制备其他细菌的化学感受器蛋白。我们已采用该方案的原始形式或稍作修改的形式，对其他此类化学感受器的配体结合结构域进行复性与纯化，用于晶体学研究。

请注意，在每种不同情况下，可能需要对实验方案进行优化，例如变性缓冲液和复性缓冲液的组成以及孵育时间。