利用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

在此，我们采用单分子FRET技术，并通过天然氨基酸掺入实现位点特异性蛋白质标记，以研究mGluR2的构象动态。该方法可在不干扰蛋白质结构的前提下研究其动态特性。原子结构仅能提供蛋白质的静态图像。

然而，单分子FRET技术使我们能够在实时和溶液环境中观察蛋白质运动的完整范围。该方法可用于研究任何蛋白质的动力学过程。此外，通过引入天然氨基酸，还可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用以及合成受体的构建。

样品加载和成像优化需要耐心和练习。首先，用记号笔在玻片上标记需要钻孔的位置。将玻片浸入水中，使用Dremel工具在玻片上钻出小孔。

将载玻片和盖玻片置于丙酮中，在23摄氏度的水浴超声仪中超声处理30分钟。倒掉盛放载玻片和盖玻片的容器中的丙酮。用清水充分冲洗，并在5摩尔的氢氧化钾溶液中超声处理30分钟。

接着，用水冲洗载玻片和盖玻片，并在甲醇中超声处理两分钟。将载玻片和盖玻片浸泡在装有甲醇的容器中，直至进行氨基硅烷化步骤。将新配制的氨基硅烷化混合液倒入盛有载玻片和盖玻片的容器中。

将载玻片和盖玻片在氨基硅烷化混合液中孵育、超声处理，然后再孵育，之后弃去溶液。接着，用甲醇清洗玻璃瓶，然后注入水。随后用水冲洗载玻片。

用气流吹干，并将它们放入组装盒中。在载玻片上加入60毫升PEG化溶液，然后在其上方放置盖玻片。储存前标记非PEG化的一侧。

孵育后，轻轻拆开装置，用水冲洗载玻片和盖玻片。然后用空气吹干，并将它们放入无菌的50毫升离心管中，使PEG修饰的表面彼此相对。用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代HEK 293T细胞后，将细胞接种到聚-L/D-赖氨酸包被的盖玻片上。

将细胞培养于添加了AZP的培养基中，并表达代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）。随后使用转染试剂对细胞进行转染，并在转染后24小时更换为新鲜的含AZP培养基。在使用炔烃氰染料标记前20分钟，用预热的记录缓冲液（RB）清洗盖玻片两次，并将其置于不含AZP的预热标准培养基中。

然后移除标准培养基，并用RB洗涤细胞，再加入 freshly prepared 标记溶液。在37°C避光孵育15分钟。孵育结束后，移除标记溶液。

用 RB 缓冲液将含有转染细胞的盖玻片洗涤两次，并重新悬浮于相同的培养基中。接着，在 4 摄氏度下以 1,000 g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，然后将沉淀重悬于 80 至 130 微升裂解液中。通过移液吹打使沉淀充分分散。

然后用锡箔纸包裹，在 4 °C 的摇床上放置 30 分钟至 1 小时，以裂解细胞。在 20,000 g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟，沉淀不溶性组分。然后将上清液转移至新的预冷离心管中，并置于冰上保存。

从冷冻箱中取出载玻片和盖玻片，置于暗处室温下回温。通过将双面胶带条夹在载玻片与盖玻片之间组装流动池，确保聚乙二醇化（PEGylated）表面朝内形成流动池的内壁。使用移液器吸头按压盖玻片，确保胶带与盖玻片和载玻片紧密贴合。

在载玻片边缘涂抹环氧树脂。向每条泳道加入40微升500纳米浓度的NeutrAvidin，并在湿润避光盒中孵育。两分钟后，用100微升T50缓冲液洗涤每个通道泳道。

然后加入20纳摩尔的生物素化抗体溶液，孵育30分钟，随后每孔用200微升T50缓冲液洗涤。打开计算机和显微镜，接着开启激光器进行预热。

接下来，打开EMCCD相机并启动软件。将样品室安装到显微镜载物台上，逐渐加入蛋白质样品，使每视野约有400个分子。用100微升成像缓冲液洗涤样品室，缓冲液中需添加0.3单位原儿茶酸3,4-双加氧酶。

调节增益、采集速率和激光功率，以在供体和受体通道中均能检测到单分子荧光信号。随后激发供体，并持续采集时间轨迹，直至视野中80%的供体分子发生光漂白。在视频结束时，打开640纳米激光器直接激发受体，直至部分分子发生光漂白。

更换视野，重复供体和受体激发的步骤，每种条件下采集三段视频。在选择用于单分子FRET轨迹的颗粒时，应挑选供体和受体信号总强度随时间保持稳定的轨迹，随后从中选择供体与受体强度呈反相关变化的轨迹。

选择显示单步光漂白且轨迹长度超过五秒的供体和受体分子。计算FRET效率缺失值。最后，按照论文中描述的步骤，通过隐马尔可夫模型（HMM）鉴定构象状态。

通过铜催化的环加成反应实现了氰基染料对AZP的标记，从而有效标记了548UAA的质膜，细胞表面群体被供体和受体荧光团标记。在SDS-PAGE电泳中，表达548UAA的HEK 293T细胞中观察到一条250千道尔顿的单一条带，与全长二聚体mGluR2的位置一致。此处展示了供体和受体漂白事件中多个短寿命和长寿命的代表性选择性轨迹。

使用隐马尔可夫模型（HMM）分析确定构象状态。从理想化的拟合结果中提取离散FRET状态之间的转换，并绘制为转换密度热图。理想化的FRET轨迹还可提供每种已识别构象的停留时间信息。

此处展示了单分子在供体和受体通道中的轨迹。此外，单分子FRET揭示了mGluR2半胱氨酸富集区的四种构象状态。高效的峰保留对于单分子下拉实验至关重要，因此在该过程中应格外注意。

此外，应在成像前立即加入氧清除剂。该标记方法及单分子FRET实验已应用于多种受体，为受体激活机制及受体功能调控提供了新的见解。