一种高效合成含混合型赖氨酸/精氨酸单体的肽拟物及其抗利什曼原虫活性评价方法

本实验的总体目标是在同一肽模拟物序列中引入赖氨酸型和精氨酸型单体，并评估这些化合物对引起被忽视热带病——皮肤利什曼病的病原体墨西哥利什曼原虫的活性。目前迫切需要为皮肤利什曼病开发新型治疗药物，而本实验方法有助于识别并开发肽模拟物作为此类被忽视热带病的一类新型潜在抗感染药物。本方案的主要优势在于能够合成含有混合阳离子功能的肽模拟物。

这一点非常理想，因为它有助于调控序列的生物活性。尽管该方法针对的是寄生虫的哺乳动物形态，但也可用于墨西哥利什曼原虫（Leishmania mexicana）的昆虫阶段，或应用于哺乳动物细胞系。对该方法进行可视化演示非常有价值，因为它展示了合成过程的逐步操作，以及墨西哥利什曼原虫在生活周期各个阶段的寄生虫培养情况。

开始此实验步骤时，按照文本方案在二甲基甲酰胺中配制溶液。然后，向一个带有两个烧结滤板的带盖20毫升聚丙烯反应容器中加入0.1毫摩尔Fmoc保护的Rink酰胺树脂。加入5毫升二甲基甲酰胺，并在室温下静置60分钟。

然后，使用固相萃取真空装置排干 DMF。接着，加入 2 毫升配制好的哌啶溶液。将容器置于摇床平台上，在室温下以 450 转/分钟振荡 5 分钟。

使用真空工作站排空溶液。然后加入 2 mL 哌啶溶液，在相同条件下振荡 15 分钟。振荡结束后，通过真空工作站排空溶液。

加入 2 毫升 DMF，混匀 30 秒以洗涤树脂。排干 DMF，并重复洗涤三次。开始亚单体合成时，加入 1 毫升配制好的溴乙酸溶液和 0.2 毫升配制好的 DIC 溶液。

在室温下振荡20分钟。然后倾去溶液，每次用2毫升DMF洗涤，共洗涤三次。加入1毫升配制好的胺溶液。

然后，在室温下将树脂振荡60分钟。弃去溶液，并用二甲基甲酰胺（DMF）每次2毫升，洗涤树脂3次。接着，加入1毫升溴乙酸溶液和0.2毫升二异丙基碳二亚胺（DIC）溶液。

室温下振荡20分钟。然后倾去溶液，每次用2毫升DMF洗涤，共洗涤三次。为了引入胍基功能化单体，向树脂中加入1毫升未保护的二胺溶液。

室温下振荡60分钟。然后，倒出溶液，并用2毫升DMF洗涤树脂3次。加入0.5毫升配制好的2-乙酰基二甲酮溶液。

室温下振荡60分钟。然后倾去溶液，并用2毫升DMF洗涤树脂三次。继续进行亚单体合成，直至获得目标序列。

然后加入 4 mL 已配制的肼溶液，在室温下振荡 3 分钟。弃去溶液，重复此步骤 3 次。随后用 2 mL DMF 洗涤树脂，每次洗涤重复 3 次。

在peptoid序列中每个游离胺上加入DIPEA和六当量的吡唑-1-羧基脒。室温下振荡反应60分钟。振荡结束后，排出溶液。

用二氯甲烷每次2毫升，洗涤树脂三次。将树脂在空气中干燥10分钟，保存以备后续使用。在加入胺类试剂后，可进行小规模裂解以检测合成反应的进展情况。

开始最终裂解时，将 4 毫升裂解混合液加入之前用于合成的同一烧结反应柱中，并盖上容器。在室温下震荡反应 90 分钟。然后使用该烧结反应柱，将裂解混合液从树脂中过滤至圆底烧瓶中。

使用旋转蒸发仪蒸发裂解混合液。加入2毫升无水乙醚以沉淀肽拟物。用移液器吸除乙醚并弃去。

然后，重复乙醚沉淀三次。沉淀完成后，将粗品肽拟物溶解于10毫升配制好的乙腈和酸化水溶液中，转移至已称重的容器内。

然后，在零下20摄氏度冷冻，并冻干成干燥粉末，以备进行反相高效液相色谱纯化。在培养利什曼原虫墨西哥株（Leishmania mexicana）并转化为无菌无鞭毛体阶段后，按照文本方案中的说明制备化合物储备液，开始进行细胞毒性检测。按照文本方案中的说明，将5毫摩尔的肽模拟物储备液、两性霉素B对照品和DMSO对照品各2微升加入96孔板的最上一排。

使用多通道移液器，向最上一排加入 48 微升新鲜培养基。向其余所有排加入 25 微升新鲜培养基。接着，从最上一排吸取 25 微升溶液，加入下一排并混匀，以此进行连续梯度稀释。

对整块板进行重复稀释，弃去从最底行移出的最后25微升。然后，将寄生虫培养物转移至50毫升离心管中。在447 × g条件下离心5分钟。

倒掉旧的培养基，加入10毫升新鲜培养基。接着用移液器将寄生虫沉淀在新培养基中轻轻重悬。使用改进型Neubauer血细胞计数板进行计数，并将培养物稀释至每毫升含八百万个寄生虫。

培养物稀释后，向每孔加入 25 µL 寄生虫。将培养板在 32 °C 下孵育 60 分钟。孵育结束后，从每孔中移除 40 µL 溶液。

向每个孔中加入90 µL新鲜培养基，在32 °C下孵育24小时。然后，向每个孔中加入10 µL基于刃天青的细胞活力溶液，在32 °C下继续孵育4小时。

孵育完成后，使用酶标仪测量荧光。通过减去平均背景值，并将各孔荧光值相对于DMSO对照组归一化后进行比较，以分析数据。在本研究中，分别使用120毫克Rink酰胺树脂合成了两种肽拟物。

产物通过反相高压液相色谱进行纯化，收集对应目标分子量的组分，并以白色粉末形式获得。此处显示两种肽拟物的收率约为30%（纯度超过90%的组分）。通过分析型反相高效液相色谱检测产物纯度，并在220纳米波长下进行检测，该波长对应酰胺骨架的吸光度。

可见两种肽模拟物均具有均一性。此处展示了针对利什曼原虫（L. Mexicana）的细胞毒性实验的代表性结果。化合物以细胞培养级DMSO配制为5毫摩尔的母液，并至少进行两次以上、每次至少三个复孔的测试，以确保数据的可靠性。

可以看出，肽拟态物B在降低可存活寄生虫百分比方面比肽拟态物A更有效，且两者均呈现剂量依赖性效应。通过观看本方法视频，您应能充分掌握如何合成、表征和纯化含有赖氨酸型和精氨酸型单体的肽拟态物，以及如何将其应用于墨西哥利什曼原虫的细胞毒性检测。我们向肽拟态物中引入双重阳离子功能的方法，仅在常用的亚单体肽拟态物合成法基础上增加了一个简单的步骤。

采用该方法，可加入不同长度的赖氨酸或精氨酸型亚单体，以增加文库的多样性，例如侧链长度为二至六个碳原子的亚单体。在进行肽拟物合成时，必须特别注意在各步骤之间充分洗涤树脂，以防止产生非预期的加成或缺失副产物。该方法为研究人员探索混合阳离子功能化肽拟物的生物活性，并将其活性与仅含赖氨酸或精氨酸型单体的肽拟物进行比较奠定了基础。

最后，请务必注意，本实验方案中使用的寄生虫及多种试剂可能具有极高危险性。因此，必须始终穿戴适当的个人防护装备，并在必要时于通风橱或微生物安全柜内进行操作。