通过光遗传变构调控实现蛋白质活性的时空控制

我们的整体研究致力于开发光遗传学方法，通过光实现对蛋白质活性的精确时空控制。我们设计了可被光调控的结构域，称为lightR，用于变构调控，从而研究时空可控的蛋白质活性如何影响细胞信号传导和功能，助力临床前疾病建模与治疗开发。光遗传学面临多项挑战，包括实现对目标蛋白质活性的精确且可逆的控制，以及准确模拟内源性信号传导的动力学特征。

关键问题包括防止非预期激活、实现靶向性的亚细胞激活，以及控制光毒性以维持细胞活性。此外，开发具有广泛兼容性和高稳定性的工具对于提升应用中的多功能性和可重复性至关重要。我们的光遗传工具（lightR工具）构建方案独具特色，将多种先进功能整合于单一系统中，包括变构调控、高灵敏度、高空间分辨率、严格的时序控制以及精确的信号特异性。

这种整合使得针对多种不同的靶蛋白具有可调节性，弥补了其他方法在这些关键能力上可能缺失一项或多项的不足。我们致力于阐明调控细胞迁移的关键信号传导和结构过程。我们的目标是利用光遗传学技术解析内皮细胞迁移及其相互作用的调控机制。

了解内皮细胞如何介导细胞外基质的重塑，并确定这些过程的失调如何促进疾病的发生。为了对lightR激酶进行生化分析，每个实验组在3.5厘米的细胞培养皿中接种1×10⁶个lin XE细胞，在37°C和5% CO₂条件下培养16至18小时。次日，使用适当的转染试剂将选定的DNA构建体转染至细胞中。

用铝箔覆盖培养皿，并放回培养箱中。转染后16至18小时，将一个465纳米的LED面板灯系统放入组织培养孵育箱内。在灯上方10厘米处放置一块带孔的有机玻璃板，以实现每平方厘米3毫瓦的光照强度。

在表达 LightR-Src 和 D388 R-LightR-Src 的细胞中使用持续光照。通过手动开关 LED 面板来控制光照。在实验时间点结束时，在安全红光条件下收集细胞，吸除培养基，并用冷 PBS 洗涤细胞。

对表达工程化 LightR-Src 的 lin XE 细胞进行 60 分钟全局光照，可观察到 Src 底物、内源性 paxillin 和 p130Cas 的磷酸化；而表达催化失活突变体 D388A LightR-Src 的细胞在全局光照下未显示 Src 底物的磷酸化。实验开始时，将每 35 毫米组织培养皿中接种 2 × 10⁵ 个 HeLa 细胞于细胞培养基中。于 37°C 和 5% CO₂ 条件下孵育细胞 2 小时。

待细胞贴壁并达到60%至70%融合度后，用所提供的混合物对hella细胞进行共转染。用铝箔包裹培养皿，以防止细胞意外暴露于光照。然后将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育16至18小时。

接下来，将直径为25毫米、厚度为0.17毫米的盖玻片放入六孔板中。用含5毫克/升纤连蛋白的PBS溶液包被三片圆形玻璃盖玻片，于37°C孵育过夜。转染后16至18小时，用PBS冲洗盖玻片。

在安全的红光条件下收集转染的 HeLa 细胞，然后在安全的红光条件下将约 1 × 10⁵ 个转染的 HeLa 细胞接种到每个盖玻片上。用铝箔包裹培养板，在 37 °C、5% CO₂ 条件下的细胞培养基中孵育 2 小时。接着，将预先配制的成像培养基和矿物油预热至 37 °C。

然后用 PBS 清洗载玻片上的细胞两次。染色并清洗细胞后，小心地将载玻片放入活细胞成像室中。向成像室中加入 1 毫升 L15 成像培养基。

加入一毫升预热的矿物油至培养基中，以防止成像过程中液体蒸发。将培养腔置于避光条件下，并在 37 摄氏度环境中孵育，直至准备成像。将培养腔放置于预热至 37 摄氏度的显微镜载物台上。

选择一个同时表达快速 LightR-Src 樱桃荧光蛋白和 Src 与 IRFP 的单细胞。选择细胞内特定的兴趣区域进行照射。在本研究中，选择所选细胞边缘的一个小区域。

在光照前，以基础状态对选定细胞每分钟成像一次，持续20分钟。随后在局部照射条件下继续成像50分钟，激活后再成像20分钟，总计90分钟。成像结束后，将视频以tif堆栈文件格式保存用于分析。

对HeLa细胞进行全局照射后，快速LightR-Src定位于黏着斑，当蓝光关闭后，该定位现象即被逆转。此光照还引起细胞铺展显著增加，而蓝光关闭后铺展停止。催化失活的D388 R-LightR-Src突变体未引起细胞铺展。

表达快速 LightR-Src 的 HeLa 细胞在局部光照后，该蛋白在黏着斑中聚集，导致在 50 分钟光照后出现局部膜突起。光照后 20 分钟黑暗期间未观察到进一步的面积增加。在黑暗阶段，快速 LightR-Src 逐渐从黏着斑中消失。

细胞的中心向光照区域移动。在快速激活 LightR-Src 后，表明细胞出现定向移动。