在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

标准化的光遗传学实验方案旨在为希望利用光刺激来调控工程化哺乳动物细胞系统中细胞特性的实验室提供指导。该方案易于实施，即使对光遗传学技术不熟悉的实验室也可采用，并提供了对工程化生物系统进行精确时空控制的方法。此方法在需要关注时空信息的特定研究领域具有广泛的应用前景，包括癌症生物学、系统生物学以及组织分化研究。

首先，选择要组合成单个基因回路或质粒的遗传元件。例如，哺乳动物DNA整合位点、光响应元件或功能基因。在组装并检查所有必要元件（如起始密码子、调控序列或翻译序列）后，使用任意基因工程与分子克隆软件对DNA序列进行注释，并将其储存以供后续使用和作为参考。

通过内置的分子克隆软件功能（例如序列比对）对质粒构建所用引物进行计算机验证。为了生成稳定的细胞系，使用包含基因回路DNA和适当重组酶的脂质体混合物，将设计的基因回路转染至目标细胞中。当细胞融合度达到80%至100%时，用含有45%旧培养基、45%新鲜培养基和10%DMSO的混合液将细胞冻存。

将剩余的细胞转移至无菌离心管中，并进行单细胞分选，将单克隆细胞分离至96孔板中。单克隆分选后约两到三周，96孔板中的孔内应出现细胞克隆灶。当细胞融合度达到50%至60%时，将细胞传代至12孔板中。

使用微控制器编程器将固件添加到组装好的 LPA 电路中。接下来，使用安装板、电路板、LED 间隔器、板适配器、24 孔板、板盖、安装螺栓、翼型螺母以及堆叠组件，将 3D 打印部件与组装好的电路板结合在一起。要开始光遗传学实验，请使用 Tabor 实验室网站上提供的 Iris 软件为 LPA 编程 SD 卡，并探索合适的光照条件。

接下来，根据所需的实验设计，输入具有技术重复的强度值。在24孔黑色培养板中，每孔加入约75,000个细胞，总体积为500 µL，然后将细胞置于含5%二氧化碳的湿润培养箱中，静置2至6小时，使其贴壁。在培养结束后，将细胞转移至组织培养超净台，取下塑料盖，于板的顶部加贴一条粘性铝箔，以尽量减少孔与孔之间的光传递，使光只能通过位于孔底部的LED进入。

将培养板放入LPA的定制3D部件中，然后用3D打印的LPA盖子盖住培养板，盖子应与设备每个角落的螺丝相匹配。将设备连接至电源，并按下LPA设备上的复位按钮，以确保更新后的LPA实验设置已生效，随后孵育细胞。孵育结束后，在组织培养超净台内，从培养板上移除铝箔条，并让培养板静置一到两分钟，以防止塑料盖上产生冷凝水。

接下来，将原始的塑料盖重新盖回培养板上，使用相应的相差显微镜或荧光显微镜对细胞进行成像。诱导后24至72小时，经胰酶消化后，将每孔约500微升的全部内容物转移至配有细胞筛网的已标记离心管中。然后使用适当的流式细胞仪分析软件，设置前向散射和侧向散射门，以筛选出大小和颗粒度合适的单个细胞，排除碎片和细胞团块。

设定门控后，使用适当的门控捕获约 10,000 个细胞，并根据所需细胞数据量调整细胞数量，随后在每管中重复捕获实验细胞。诱导和胰酶消化后，将每孔约 500 微升的全部内容物转移至已标记的试管中。在 400 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液后，将样品转移至化学通风橱中。

将细胞重悬于750至1,000 µL用PBS稀释的4% PFA中，上下吹打数次以打散细胞团块。室温孵育15分钟后，加入750至1,000 µL PBS，再次上下吹打数次，然后在室温下以400 × g离心5分钟使细胞成团。弃去上清液后，将样品转移至化学通风橱中，并如图所示将细胞重悬于750至1,000 µL预冷甲醇中，随后置于-20 °C冰箱中静置30分钟。

孵育结束后，加入 750 至 1,000 微升 PBS，并用移液器上下吹打数次。然后在 400 × g 条件下离心细胞 5 分钟，弃去上清液，将样品转移至化学通风橱中。用 100 微升或其他合适稀释浓度的标记一抗重悬细胞，上下吹打 6 至 8 次，室温孵育 1 小时。

接着，加入 750 至 1,000 微升孵育缓冲液，用移液器反复吹打数次，然后在 400 × g 条件下离心细胞 5 分钟。随后，将细胞重悬于 500 微升 PBS 中，并通过反复吹打分散细胞团块。将每根试管中的全部内容物转移至带有细胞筛网的已标记试管中。将细胞送至配备合适激光波长的流式细胞仪进行检测。

对设备进行了光学校准。利用获取的图像，计算了LED的补偿值，扣除了背景信号，并推导出像素强度。96个孔之间的变异系数最小。

校准软件展示了LED光源因位置不同而产生的差异，并创建了灰度调节，使每个LED的强度均一化至相同水平。通过荧光显微镜观察，在LPA上以不同光脉冲持续时间诱导工程化光敏细胞的基因表达，并对细胞进行明场和GFP表达成像。利用流式细胞术，在不同脉冲长度下诱导细胞，结果显示在群体水平上基因表达呈剂量依赖性响应，相较于未诱导状态，表达量变化超过四倍。

通过比较较弱系统在不同光照强度下的表现与Vivid或光照开启状态，发现负反馈实现了五倍以上的基因表达噪声降低。qPCR分析显示，经改造的lighter细胞以剂量响应方式表达RNA水平，相较于未诱导状态，诱导水平超过十倍，与流式细胞术定量结果一致。经改造的lighter基因回路在蓝光强度增加时，导致KRAS蛋白水平和磷酸化ERK水平随之升高。

可进行多种功能检测，包括生长、细胞运动、伤口愈合、增殖或侵袭实验。这些方法可为癌症生物学、组织分化或药物耐受机制提供特定的见解。