甲醛交联辅助的调控元件分离法用于检测哺乳动物细胞中的染色质可及性

本实验的总体目标是通过将DNA与其相关蛋白共价交联，随后纯化并定量游离DNA，从而确定特定基因位点的染色质可及性。该方法有助于解答染色质研究领域的关键问题，因为无论在未经处理的细胞中，还是在正在进行染色质重塑的细胞中，均可测定DNA的可及性。该技术的主要优势在于无需使用酶来切割DNA，也无需针对每种实验条件进行滴定的抗体。

该方案的额外优势在于，除超声波破碎仪外，无需任何特殊设备。本实验操作将由本实验室的博士研究生 Olesja Ritter 和 Tabea Riedlinger 演示。开始实验时，将甲醛直接加入前一天接种的细胞培养基中，使其终浓度达到1%（体积分数）。

将培养基在室温下孵育10分钟，每2分钟手动摇动培养板一次。随后，加入甘氨酸至终浓度为0.125摩尔，以淬灭甲醛。将溶液在室温下孵育5分钟，每2分钟摇动一次。

吸弃培养基，然后沿培养皿壁小心加入预冷的PBS以洗涤细胞。吸弃PBS，重复洗涤两次。第三次洗涤后，将细胞重悬于1毫升预冷的PBS中，必要时使用细胞刮刮下细胞。

将它们转移至预冷的1.5毫升离心管中，置于冰上。在4°C条件下，于预冷的台式离心机中以300×g离心5分钟。小心吸除并弃去上清液。

用一毫升 FAIRE 裂解缓冲液重悬细胞沉淀，轻轻吹打数次。将细胞在冰上孵育 20 分钟。孵育结束后，对交联的 DNA 进行超声处理，使其片段化至平均长度为 200 至 300 个碱基对，并在超声过程中冷却样品，以避免样品过热。

DNA 的片段化对本实验至关重要，因为片段大小会影响整个技术方案的灵敏度，因此必须在实验前仔细确定超声处理条件，并在每次实验中检测染色质片段的大小。在 4 摄氏度下以 13,000g 离心样品 15 分钟。然后，将上清液转移至新的反应管中。

将样品分装为100微升的等份。取一份100微升的等份用于逆转交联，并作为总DNA的参照。加入10微升RNase A，37摄氏度孵育一小时。

接下来，加入10 µL蛋白酶K。使用可编程恒温金属浴，将样品在37°C孵育4小时，随后在65°C孵育6小时，以切割蛋白质并逆转交联。取一个新的100 µL等分试样，加入10 µL RNase A，并在37°C孵育1小时。孵育结束后，将此前步骤中获得的未去交联样品与去交联样品平行进行后续操作。

加入 H2O 至终体积为 300 微升。然后在通风橱中加入 300 微升苯酚-氯仿-异戊醇，剧烈涡旋振荡。将样品在 4 摄氏度、13,000g 条件下离心 10 分钟。

接下来，小心地将上层水相的 280 微升转移至新的反应管中。注意不要吸取位于中间相的任何杂质，因为其中含有蛋白质，剩余的下层相应作为有机溶剂废弃物丢弃。重复上述处理步骤，并小心地将上层水相的 270 微升转移至新的反应管中。

在通风橱中加入 270 微升氯仿，并剧烈涡旋。离心样品。离心后，小心转移 250 微升上层水相至新的反应管中，注意避免带入任何中间相的杂质。

将剩余样品作为有机溶剂废弃物丢弃。然后加入25 µL 5 M氯化钠、250 µL异丙醇，并加入5 µL作为DNA载体的糖原。倒置离心管并在室温下孵育。

孵育后，离心样品以沉淀DNA。接着，用400 µL体积分数为70%的乙醇洗涤DNA沉淀，并再次离心样品。小心吸除上清液，将沉淀在室温下干燥10分钟。

待沉淀干燥后，将其重悬于100微升TE缓冲液中。将未去交联的游离DNA样本在65摄氏度下孵育4小时，以去除DNA间的交联。最后，使用分光光度计定量DNA含量，并取少量等分试样在2%（质量/体积）琼脂糖凝胶上电泳，以检测片段大小。

将HeLA细胞用TNF刺激一小时后进行FAIRE分析。测定ACTB基因（编码β-肌动蛋白的基因，作为阳性对照）、12号染色体上的异染色质区域（作为阴性对照）以及IL8启动子区域的游离DNA与总DNA的比值。通过溴化乙锭染色凝胶显示不同超声处理时间的结果，表明经过20分钟超声处理后，染色质片段大小达到最佳，为200至300个碱基对。

一旦掌握，该技术可在两天内完成。通过此操作步骤，还可进一步开展深度测序等其他方法，以在全基因组水平上确定染色质的可及性。切勿忘记，甲醛和苯酚-氯仿的使用具有极高的危险性，操作时必须采取预防措施，例如在通风橱中操作、佩戴手套，并妥善处理废弃物。