利用两种稳定同位素标记的鞘磷脂物种通过液相色谱-质谱法测定鞘磷脂的定量与定性方法

本实验的总体目标是精确分析生物样品中每种鞘磷脂组分的含量及其结构。该方法有助于解答脂质研究领域中有关脂质生物学和脂质代谢的关键问题。该技术的主要优势在于，我们可通过色谱-质谱联用系统对生物样品中的多种鞘磷脂组分进行表征。首先，从含有HeLa细胞的10厘米组织培养皿中移除培养基，并用6毫升冰上预冷的PBS缓冲液冲洗细胞两次。

然后向10厘米的组织培养皿中加入1毫升冰冻的PBS，并使用细胞刮刀收集细胞。细胞从培养皿表面脱离后，将细胞转移至2毫升硅化塑料管中。离心后，弃去上清液，并向每份细胞沉淀中加入1毫升甲醇。

然后短暂涡旋振荡试管。接着将样品放入浴式超声仪中，在200瓦功率下超声处理5分钟。完成后，将整个细胞匀浆转移至配有聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的试管中。

向每支试管中加入1毫升甲醇、1毫升氯仿、0.8毫升双蒸水以及50微升浓度为10微摩尔的内标物。盖紧管盖，在室温下以2,500 rpm剧烈涡旋振荡5分钟。然后向每支试管中再加入1毫升氯仿和1毫升双蒸水。

再次在室温下以 2,500 rpm 的速度剧烈涡旋振荡试管 5 分钟。接着离心样品，以彻底分离水相和有机相。将下层相转移至一次性玻璃试管中。

向试管中加入 2 毫升氯仿。然后在室温下以 2,500 转/分钟剧烈涡旋振荡 5 分钟，以充分混合上层相和中间相絮状物。经过第二次离心后，将修饰后的下层相与初始下层相一同转移至一次性玻璃试管中。

现在将玻璃管置于氮气流下约60分钟，彻底除去收集到的下层相中的有机溶剂。最后，用500微升甲醇或乙醇重新溶解样品。使用0.02微米滤膜将所得混合物过滤至玻璃小瓶中。

然后将样品在-20摄氏度下保存。对标准品进行系列稀释，并将每种浓度的50微升分别加入不同的试管中。接下来，制备三个质控样品：向第一个样品中加入接近标准曲线下限三倍浓度的量，向第二个样品中加入接近标准曲线中心浓度的量，向第三个样品中加入接近标准曲线上限浓度的量。

然后将一毫升甲醇中的细胞匀浆液加入每支试管中，并使用刚刚展示的方法从每个样品中提取总脂质组分。首先，配制流动相。按2:2:1的比例混合乙腈、甲醇和双蒸水，作为水相。

使用异丙醇作为有机相，盛装于带聚四氟乙烯衬里螺旋盖的玻璃瓶中。随后将两种流动相置于浴式超声仪中，超声处理5分钟。然后向每种流动相中分别加入甲酸，使其终浓度为26.4毫摩尔，以及14.9毫摩尔的氢氧化铵。

进行定性分析时，启动高效液相色谱系统。将进样管插入装有流动相的玻璃瓶中，并对高效液相色谱管路进行冲洗。然后将C18高效液相色谱柱连接至高效液相色谱系统。

将色谱柱温箱的温度保持在50摄氏度，并以100微升/分钟的流速用 aqueous 流动相平衡色谱柱。运行过程中，将样品放入自动进样器的样品架中。根据随附文本方案中的表一和表二所列参数，设置三重四极杆和线性离子阱串联质谱系统，用于三级质谱分析。

同时，按照随附文本方案中详细描述的方法，设置目标鞘磷脂（Sphingomyelin, SM）种类的第一和第二前体离子参数。创建批处理文件，并提交该批处理文件，通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析，获取每种鞘磷脂种类的三级质谱产物离子谱图数据。通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析，获得目标鞘磷脂种类的三级质谱产物离子谱图。

然后，通过比较产物离子质谱图中目标鞘氨醇长链碱基和n-酰基部分的精确质荷比，分别为每种鞘磷脂指派三个产物离子质谱。按照随附文本方案所述，采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析对鞘磷脂进行定量分析。随后，使用软件处理多反应监测数据，进行数据积分，以获得每种鞘磷脂分子物种的提取离子色谱峰面积数据。

定量分析每种神经鞘磷脂（Sphingomyelin）组分，并按照随附文本方案中的描述绘制标准曲线。此处展示了化学合成的神经鞘磷脂以及从HeLa细胞中提取的脂质样品中所含神经鞘磷脂的质谱图。值得注意的是，在两个样品中，去甲基鞘氨醇磷酸胆碱（demethylated sphingosylphosphorylcholine）的信号强度均高于SM的n-酰基部分。

此外，鞘氨醇-1-磷酸对应的质谱峰可用于推测鞘磷脂中鞘氨醇长链碱基的碳原子数和双键数目。在本定量方法中，为验证该方法而精确制备用于构建校准曲线的样品至关重要。与使用权重因子为1或1/x相比，采用权重因子为1/x²时，低浓度下的曲线拟合明显得到改善。

该技术为生物学和工业领域的研究人员提供了表征生物样本及工业产品（如化妆品）中多种鞘磷脂种类的方法。观看本视频后，您应能够准确理解如何分析生物样本中每种鞘磷脂的含量及其结构。请注意，操作吸收性试剂时可能存在极高危险性，因此在执行该实验步骤时，必须采取适当防护措施，例如正确佩戴防护眼镜。

此外，必须佩戴手套，以防止手部分泌的脂质造成污染。