MassSQUIRM 定量检测赖氨酸去甲基化酶活性的应用

质量squirm技术旨在利用同位素标记甲基化和基质辅助激光解吸电离质谱法来定量赖氨酸去甲基化酶活性。首先，在含有甲基化赖氨酸的肽段上进行酶促去甲基化反应；随后，使用氘代甲醛对去甲基化反应产生的肽段产物进行化学再甲基化，生成完全甲基化的肽段，使其在基质辅助激光解吸电离过程中具有相同的离子化效率；接着，通过多级质谱对每种肽段种类进行定量，并校正同位素峰重叠效应。为了鉴定未甲基化、单甲基化、二甲基化和三甲基化肽段的相对含量，质量squirm技术根据质量变化来确定每种去甲基化反应产物的相对丰度。

与常规的霉菌质谱等现有方法相比，该技术的主要优势在于质谱评分能够考虑不同甲基化肽段之间电离效率的差异。我们最初是在开发一种利用同位素标记的重乙酸酐来测量组蛋白乙酰化水平的方法时，提出了这一思路。该技术面临的挑战是提取峰面积数据，而肽段同位素峰簇的重叠可能使这一过程变得复杂。

将125纳克重组的特异性赖氨酸去甲基化酶1酶与0.25微克生物素标记的二甲基化组蛋白H3肽在20微升去甲基化酶缓冲液的终体积中混合，进行去甲基化反应。同时准备一个对照样品，其中含有0.25微克肽但不含LSD1酶，将反应管和对照管在37摄氏度下孵育两小时。接下来，为准备R2 20微米多孔珠，将等体积的珠子与甲醇混合。

然后向样品中加入10倍体积的三氟乙酸-甲酸，每个样品加入8微升多孔微珠，室温下振荡15分钟。同时，对两个C18柱尖进行预处理：用20微升0.1%三氟乙酸-70%乙腈溶液吹打洗涤4次，再用20微升0.1%三氟乙酸溶液吹打洗涤4次。

接下来，将两个样品加载到已活化的 Zip Tip 上。使用移液器将液体体积缓慢推过 C18 树脂，重复此操作，直至两个样品的总体积均完全通过 Zip Tip。

随后用 20 微升 0.1% TFA 溶液洗涤 ZipTip 两次，再用 40 微升洗脱缓冲液洗脱样品，并使用真空浓缩仪将洗脱液完全干燥。首先将样品重悬于 100 微升 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，然后加入 8 微升硼氢化二甲胺和 16 微升去重水合甲醛。

在 4 摄氏度下孵育 2 小时。加入硼氢化二甲胺和氘代甲醛，再次进行还原性甲基化反应，并孵育 2 小时。第三次加入硼氢化二甲胺，在 4 摄氏度下孵育 15 小时。

用12.5微升1摩尔Tris（pH 7.4）终止反应，然后使用真空浓缩仪将样品完全干燥。首先，将对照组和去甲基化酶反应样品重悬于100微升50毫摩尔磷酸缓冲液（pH 7.4）中。

现在向对照组和去甲基化反应样品中各加入八微升多孔微珠，按照之前所示方法用 Zip Tip 收集。用两微升体积洗脱至 MALDI 样品靶板上，室温下静置干燥至结晶。随后进行质谱分析。

将谱图文件导入工作软件，并导出至 m/z 软件。进一步通过串联质谱法验证反应产物。首先，测定对照样品中碳 13C2 和碳 13C4 同位素相对于单一同位素峰的峰面积比。

利用这些计算出的比值来量化每种修饰状态下存在的肽段相对含量，以确定去甲基化反应样品的状态。LSD1 酶可有效用于赖氨酸去甲基化的质谱定量分析。

由于对照反应未经过还原性甲基化处理，因此显示出该肽段典型的同位素峰簇。由此得到的峰面积可确定肽段中碳13C二和碳13C四存在状态的背景比率。通过对照反应的质谱峰面积，可对每种修饰状态下的肽段相对含量进行定量分析。在去甲基化反应中，根据对照反应和去甲基化反应的峰面积，确定了赖氨酸4位点的修饰比例为：33.7%的二甲基化、42.0%的一甲基化和24%的未甲基化。

这种大规模角质化方法为组蛋白表观遗传学领域提供了关键见解，例如组蛋白赖氨酸残基的去甲基化如何参与多种疾病的发生发展。尽管该甲基化检测方法已用于去甲基化酶的研究，但也可用于甲基转移酶的研究。