RNA干扰的实际应用：利用脂质体载体口服递送双链RNA至蟑螂

本实验方案的总体目标是通过口服摄入由脂质体载体包裹的双链RNA，利用RNA干扰技术降低蟑螂肠道中的基因表达。该方法有助于回答害虫防治新技术研发中的关键问题，例如：在开放环境中敲低必需基因是否能够杀死害虫？该技术的主要优势在于，脂质体可保护基因特异性的双链RNA，确保其有效递送至靶细胞。

演示该实验步骤的是我实验室的博士后黄Jia-Hsin和技师刘Yun。首先，将蟑螂置于冰上麻醉，直至其静止不动达三分钟。随后，用拇指和食指拿起一只昆虫，使其腹面朝上。

接下来，使用解剖剪在后肢基节与转节之间的位置剪断基节末端。在基节其他位置剪切会降低血淋巴采集效率。现在，将一支10微升微量移液器置于切口处，轻轻挤压腹部，同时吸取流出的血淋巴。

重复此过程，直至将五只蟑螂的血淋巴收集到同一个微量离心管中。接下来，将混合的血淋巴短暂离心10秒。然后，取10微升血淋巴与50微升1×昆虫生理盐水缓冲液混合。

现在，将稀释后的血淋巴离心10分钟，以沉淀血细胞。然后，将上清液转移至新管中。最后，使用微体积紫外-可见分光光度计测定总蛋白浓度，并将每个样品的浓度调整为每微升含6毫克蛋白。

为了收集中肠汁液，首先将蟑螂置于冰上进行麻醉。然后将其转移至盛有冰冷的1×昆虫生理盐水缓冲液的解剖板上，用昆虫针固定，使腹部朝上。接着，使用精细镊子解剖腹部。

然后，取出整个肠道，并将其转移至含有1×昆虫生理盐水缓冲液的新培养皿中。接着分离中肠，即位于嗉囊与马氏管之间的区域。为此，移除动物的前部结构以及后肠部分。

接下来，迅速将中肠转移至含有 100 µL 昆虫生理盐水缓冲液的微量离心管中。将六只蟑螂的中肠收集到同一根离心管中。然后，涡旋振荡该离心管 10 秒。

接下来，将混合物离心10分钟，以分离血细胞和肠道组织。然后，将上清液转移至洁净的微量离心管中，并调整蛋白浓度至每微升含6毫克蛋白。双链RNA脂复合物必须在制备后1小时内使用。

在制备过程中，务必同时将所有稀释后的试剂与稀释后的双链RNA混合。然后迅速涡旋并孵育该混合物。待准备就绪后，取4微升双链RNA溶液与10微升昆虫生理盐水缓冲液混合作为对照，或与10微升来自血淋巴或中肠液的提取酶混合。

接下来，通过加入 2 µL EGTA 制备酶抑制对照；否则，加入 2 µL 无 RNase 水。然后，在 25 °C 下孵育样品 1 小时或更长时间。

孵育后，加入200微升提取试剂和40微升氯仿，然后涡旋振荡。接下来，将样品离心10分钟。随后，将每个上清液中的150微升转移至新管中，通过加入150微升异丙醇并在冰上孵育15分钟，使每个样品中的双链RNA沉淀。

孵育结束后，再次离心样品并弃去上清液。随后，通过向每个沉淀中加入200 µL 70%乙醇并离心管体，对RNA沉淀进行两次洗涤。第二次洗涤后，使用离心真空浓缩仪干燥双链RNA沉淀，持续3分钟。

然后，将沉淀重悬于10 µL无RNase的水中。最后，使用1.5%琼脂糖凝胶检测处理后的双链RNA的完整性。每天喂养蜚蠊两次，分别在光照开始后一小时和光照结束前一小时进行。

连续进行 8 或 16 天，中间不得中断。在此期间，应使蟑螂完全断水。喂食时，需准备好 freshly prepared 双链 RNA 脂质复合物和裸露的双链 RNA。

对于推注，使用4 µL双链RNA脂质复合物或250 ng裸双链RNA。喂食蟑螂时，首先用柔软的镊子夹住其翅膀。切勿抓握蟑螂的身体部位。

然后，缓慢地将一滴溶液用移液器滴至蟑螂口器附近，观察其摄入液滴的过程。最后一次喂食后，为蟑螂提供水瓶。在整个喂养期间，每天对昆虫进行观察，检查其死亡情况，并将不再活动的个体及时从实验中移除。

持续口服给予双链tub脂质复合物可使中肠中微管蛋白表达量从第9天的40%下降至第17天的60%。相比之下，裸露的双链RNA无此效果。这很可能是因为裸露的双链RNA在接触中肠液后1小时内即被降解，而脂质体偶联的双链RNA则保持稳定。

不仅RNA水平下降，持续喂食微管蛋白双链RNA脂质复合物还导致显著的致死效应。这种致死效应不太可能由载体引起，因为携带EGFP双链RNA的脂质复合物未导致任何致死现象。在尝试这种RNA干扰的口服递送系统时，重要的是要连续数天持续喂食双链RNA。

一旦掌握，只要操作得当，每只昆虫的饲喂步骤可在两分钟内完成。如有需要，可采用不同配方的脂质体纳米颗粒，以优化饲喂过程和提高RNAi效率。最终，该技术使得害虫管理领域的研究人员能够利用RNAi探索新的防控策略。