中国台湾甲虫 Dermestes maculatus 的饲养及双链RNA介导的基因敲低

本实验的总体目标是探索鞘翅目昆虫这一多样化类群的代表性新昆虫模型系统——斑拟 beetles（Dermestes maculatus）中的基因功能，从而促进基础与应用研究问题的研究。该方法使得在斑拟 beetles 的胚胎和成虫中检测基因功能成为可能，有助于回答发育生物学、进化生物学及其他领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于，仅需序列信息即可利用 RNA 干扰技术靶向任意基因，即使在缺乏完整基因组序列的情况下也同样适用。

本文介绍的方法不仅为研究埋葬虫（Dermestes）的基因功能提供了途径，还可用于开发新的昆虫模型系统，并有望用于害虫控制。准备大眼斑皮蠹（D. maculatus）的饲养笼时，首先在中等大小的昆虫饲养笼内铺上一层薄薄的木屑。

在笼子中放入一块泡沫塑料，为幼虫提供化蛹的环境。向笼子中添加20至50只成年甲虫或末龄幼虫。将湿润的猫粮放入培养皿或称量舟中，作为食物来源。

用网状布覆盖笼子，并将其放入培养箱中。在开始收集胚胎之前，首先仔细检查笼子内是否有存在的胚胎，并将其移除。待笼子清理干净后，将一个拉伸的棉球放入笼内，并将群体在30摄氏度条件下进行培养。

在适当的时间窗口后，收集棉球，移除存在的成虫，并将其放回笼中。在一张黑色卡纸上，轻轻挤压棉球，缓慢将其撕成细丝，使存在的任何卵都落入黑色纸上。取一个标准的培养皿盖，用一张黑色滤纸覆盖其内表面。

在标准显微镜载玻片的边缘贴上一条双面胶带。将显微镜载玻片放置在培养皿盖内的黑色滤纸上。取含有收集到的胚胎的纸片，轻轻敲击，使胚胎转移至培养皿盖中。

使用画笔将胚胎在胶带上垂直于载玻片排列，使胚胎的前端或后端朝向边缘。开始RNAi实验时，首先用20微升移液器吸头吸取2–4微升dsRNA。将吸头插入预先拉制好的玻璃毛细管（称为针头）中，并轻轻将溶液移入针头内。

将针固定到玻璃毛细管夹持器中，然后将毛细管夹持器安装到显微操作仪上。接着，小心地将带有附着胚胎的载玻片转移至解剖显微镜的载物台上。移动载玻片，使一个胚胎位于视野中央，并调节显微镜焦距。

在解剖显微镜下观察，使用显微操作器调整毛细管尖端的位置。将毛细管尖端移至排列中第一个胚胎末端附近。打开氮气或空气供应，然后将电磁阀输入选择开关调至真空档。

根据仪器情况，将喷射压力调节器调整至 10–15 psi。打开毛细管，带有颜色的双链 RNA 溶液将充满尖端，准备进行注射。向前移动毛细管尖端，轻柔地刺入胚胎。

在理想的压力设置下，毛细管中不会流入胚胎液。踩下脚踏开关，将dsRNA注入胚胎，直至注入适当的量。将毛细管尖端留在胚胎内约两秒钟，然后小心取出。

所有胚胎注射完成后，将载玻片放入培养皿中。在培养皿中加入一个湿润的棉球，注意避免棉球与载玻片接触。盖上培养皿，并用封口膜包裹。

用dsRNA类型、浓度、日期、时间和注射的胚胎数量进行标记。最后，将培养皿放入30°C的培养箱中，直至胚胎孵化。为了进行pRNAi，首先从种群中收集蛹。

将雄性和雌性蛹分别挑出，放入两个不同的培养皿中，并置于30摄氏度的培养箱内。每天检查培养皿中羽化的甲虫，将已羽化的个体分别转移到两个用于雄性和雌性成虫的培养皿中。每隔一天喂食成虫并更换培养皿，直至获得足够数量的羽化成虫以开始显微注射。

成虫群体准备就绪后，先将一只雌性甲虫麻醉，用一只手将其腹面朝上固定，另一只手握住注射器。轻轻刺穿第二和第三腹板之间的节间膜，观察注射器刻度，缓慢注入约 2 µL 液体至每只雌虫体内。

注射后，保持针头静止至少5秒，然后小心拔出。将已注射的雌虫转移至含有猫粮的培养皿中。妥善标记培养皿。

将培养皿放入30°C的培养箱中。24小时后，将注射过的雌性个体转移到小型笼子中，并加入等数量未注射的年轻雄性个体。标记笼子，并添加猫粮。

将笼子放入30摄氏度的培养箱中，以允许交配。随后可检测产生的后代，以确定pRNAi的效果。此图像显示的是注射了DS GFP（绿色荧光蛋白）作为对照的pRNAi个体的后代。

此处，与野生型个体相同，孵化出的子代表现出每体节具有一条色素带。相邻的色素带之间由无色素区域隔开。在进行配对pRNAi后，受影响的子代孵化时出现相邻色素带融合的现象，表明体节边界发育存在缺陷。

表型严重程度存在变异，但融合现象始终出现在特定的边界区域，表明存在类似成对规则基因的缺陷。同样，经成对基因敲降后未孵化胚胎的角质层表型显示腹部节段缺失，以及体长缩短。利用engrailed抗体对早期胚胎进行染色以检测分子缺陷，结果显示对照个体中每个节段均表现出强度相等的条纹状表达。

相比之下，在注射了 Dmac 配对 dsRNA 的雌虫后代中，检测到基因表达在交替的条带中减弱。这种表达降低的模式与受影响孵化幼虫中观察到的表皮缺陷模式一致。在此，我们首次介绍了利用RNA干扰技术在斑蝇（Dermestes maculatus）早期胚胎发育过程中敲低目标基因的实验方案。

在进行这些操作时，重要的是要记住使用处于适当发育阶段的胚胎或雌性成虫。一旦掌握，大约可在半小时内完成对100个胚胎或10只雌性成虫的显微注射。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如胚胎染色或定量PCR，以探究基因调控机制相关的更多问题。

观看本视频后，您应能够充分了解如何建立 Dermestes 实验室种群，以及如何在此甲虫中进行胚胎期和亲代的 RNA 干扰实验。目前可用于功能研究的昆虫模型种类仍然较少。本文介绍的技术为研究人员将 Dermestes 用作模式系统铺平了道路，从而扩大了适用于分子遗传学分析的昆虫范围。