水生甲虫中RNA干扰作为在特定发育时间点操控基因表达的有力工具

尽管基因编辑技术已广泛应用于非模式生物分子遗传学的研究，RNAi 仍然是一个强大的协同工具。该技术的主要优势在于可应用于不同的发育阶段。此外，还可利用部分基因沉默来研究这些完整基因的功能。

该操作的成功依赖于 DSR 的注射以及尽可能减少损伤。这需要一定练习，因此如果需要多次尝试才能掌握，请不要气馁。为了准备早期胚胎进行显微注射，首先将煮沸的 20% 琼脂糖倒入一个小培养皿中，并在琼脂糖凝固前，将三根直径为一至二毫米的塑料管放置在其表面。

待琼脂糖凝固后，用一对钝头镊子取出试管，并在留下的凹陷处覆盖500 µL经高压灭菌的蒸馏水。当收集容器准备好后，在体视显微镜下，用精细的天然毛刷将五个八小时龄的T.marmoratus胚胎从甲虫巢穴位点转移至盛有高压灭菌蒸馏水的玻璃凹面载片中。在显微镜下使用精细解剖镊子，从两侧夹住每个胚胎的卵壳，撕开卵壳，使胚胎轻柔地从组织中滑出。

将所有收集的胚胎去除两层绒毛膜后，用毛笔小心地将胚胎从玻璃凹皿转移到已制备好的琼脂糖平板的凹槽中。要向早期胚胎注射基因特异性的双链RNA，首先使用针头拉制仪制备显微注射针，并在体视显微镜下用镊子将每根针尖折断至形成锋利的边缘。将纯化的目标双链RNA贮存液置于冰上后，向其中加入1微升10倍浓度的注射缓冲液，再用双蒸水将溶液终体积补至10微升。

使用 P10 移液器将一种制备好的显微注射针回填工作浓度的双链 RNA 溶液，并将该针装入连接至采用压力喷射技术的显微注射系统的微针夹持器中。打开显微注射系统和加压空气供应，使用显微注射系统上的微调阀将注射压力设定为每平方英寸 15 磅，然后使用时间调节旋钮将注射持续时间设定为秒。为校准注射针，可通过在空气中注射评估针尖形成的液滴体积；对于 T.marmoratus 胚胎，最佳液滴大小为 100 至 200 微米。

如果在每平方英寸15磅压力下，注射持续时间约为3秒时能够获得理想的气泡，则表明注射针质量良好。当针头装置准备就绪后，将针头对准胚胎琼脂糖平板上的胚胎，使针头以45至60度的角度接近胚胎。使用显微操作器缓慢移动微针，直至针尖接触一个胚胎中心表面，然后小心地向前推进针头，直至刚好刺入胚胎表面。

当针头进入胚胎后，小心按下显微注射仪的注射按钮，将一到二纳升的双链RNA注入胚胎内。待所有RNA注入完毕后，缓慢地将针头从胚胎中撤出，避免导致胚胎破裂。成功注射的胚胎可通过注射部位出现的有色斑点进行识别。

将所有胚胎注射完毕后，小心地将培养皿放入湿度培养箱中，并置于25摄氏度、14小时光照/10小时黑暗循环条件下培养4至5天。每天在体视显微镜下观察胚胎发育情况，以识别形态学上可见的基因敲低表型。使用高分辨率数码相机记录发育过程。

每天清除死亡的胚胎，并补充琼脂平板上的水，以避免在孵育期间发生干燥以及微生物污染扩散至其他存活的胚胎。在收集幼虫前，先将60至70摄氏度的2%液体琼脂糖加入一个小的培养皿中。当琼脂糖凝固后，使用钝头镊子为每只待注射的幼虫在琼脂糖中制作一个浅坑，并轻轻倒掉幼虫培养杯中的水。

麻醉后，使用钝头镊子小心地将幼虫放置在固定板上，使幼虫的颈部和身体位于凹槽内，而尾部位于琼脂糖表面之上。当所有幼虫均放置完毕后，用一层仍处于液态但无烫伤风险的较厚琼脂糖覆盖每只幼虫，并根据需要及时释放不慎被覆盖的尾部。进行双链RNA显微注射时，按所示方法，将目的基因特异性的双链RNA工作液吸入显微注射针中。

拉动手动控制显微注射器的推杆，将注射针安装到显微注射系统上。将固定的幼虫置于体视显微镜下，使注射部位与显微注射针的运动轨迹对齐，并保持相对平缓的角度。使用显微操作器小心地将针尖插入幼虫体内，缓慢而谨慎地对注射器施加压力，并根据需要通过观察针内有色注射液的流动情况调节注射压力。

当所有 RNA 注射完成后，使用软镊子将幼虫从琼脂糖中取出，并将其放入盛有室温水（25 至 28 摄氏度）的新容器中，保持 14 小时光照、10 小时黑暗的光周期。在此代表性分析中，对日斑潜甲虫 T.marmoratus 在多个不同发育阶段的三种不同基因进行了基因沉默。RNA 干扰通过在胚胎发生的极早期注射双链 RNA 来实现。

部分胚胎无法存活于该操作过程，发生坏死。在这些图像中，可观察到一个个体，其眼睛颜色略浅。在该个体中，可观察到更严重的基因敲低现象，其中细胞簇更腹侧的区域完全无色素，但背侧区域仍保留部分色素。

此处展示另一例眼睛几乎完全丧失色素的个体。在幼虫中敲低 Lac2 会导致体壁色素减少，成体个体颜色较浅，且翅膀可能出现一定程度的畸形，这可能是由于组织异常柔软所致。务必仔细观察，每天密切检查注射后的动物，并立即移除任何死亡个体。

该技术的优势在于可应用于多种不同生物的基因。该技术也已广泛而成功地应用于进化发育生物学。