通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定小鼠组织提取物中蛋白酶特异性的方法：调控pH值以诱导特异性改变

本实验的总体目标是确定多种粗提物中的蛋白酶特异性。该方法有助于回答关键问题，以确定蛋白酶的特异性。该技术的主要优势在于，能够同时鉴定多个样品的蛋白酶特异性。

将从雄性ICR小鼠获取的肺组织样本置于冰上冷却。在搅拌器中以20,000 RMP均质化30秒。重复此步骤，直至样本完全均匀。

为避免温度升高，匀浆时间不得超过连续一分钟。取1,000微升匀浆液转移至1.5毫升离心管中，在4摄氏度条件下以10,000 × g离心5分钟。将500微升上清液转移至新的1.5毫升塑料离心管中。

使用 10 微升样品测定蛋白质浓度。可采用双辛可宁酸法（bicinchoninic acid assay）或 Bradford 法。为防止冻结，向样品中加入 80% 甘油，使甘油的终浓度为 50%。

为了阐明蛋白酶特异性在不同 pH 条件下的差异，使用 pH 为 3、5、7 和 9 的消化缓冲液。在 890 微升消化缓冲液中，加入 10 微升浓度为 0.1 微克/微升的 TPCK 胰蛋白酶、0.1 微克/微升的金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶，或 10 微克/微升的组织提取物。通过将组织提取物中的蛋白酶在沸水中孵育 10 分钟使其失活，制备阴性对照。

接下来，向样品中加入10 µL MNO生物素标记底物，在37°C下孵育3小时以进行消化。孵育结束后，将样品置于沸水中加热10分钟以终止底物消化反应。随后在4°C、10,000 ×g条件下离心5分钟，收集消化后的底物。

将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。加入50毫升含0.1%聚氧乙烯辛基苯基醚的1摩尔Tris缓冲液中的50%链霉亲和素Sepharose微珠。使用pH试纸检测，确保溶液pH值约为9。

调节至合适的 pH 值至 9 或更高非常重要。只有在 pH 值为 9 或更高时，氨基生物素才能与珠粒结合。如果溶液的 pH 值较低，可通过加入更多缓冲液将其调节至约 pH 9。

如有需要，可加入 1 M Tris 缓冲液以调节 pH 值。将悬浮液在 4°C 条件下于旋转摇床上持续温和混匀孵育过夜，使 MNO 生物素标记的底物与链霉亲和素结合。孵育过程中，磁珠应始终保持悬浮状态。

第二天，在 4°C 条件下以 10,000 × g 离心样品 1 分钟。去除上清液后，加入 1,000 µL 洗涤缓冲液洗涤磁珠。然后在 4°C 条件下于旋转仪上持续轻柔混匀孵育 10 分钟。

在4°C条件下，以10,000 × g离心珠子1分钟。弃去上清液，并重复此洗涤步骤四次。接着，向珠子中加入100微升0.2%三氟乙酸。

使用 pH 试纸确保溶液的 pH 值低于 2。如果溶液的 pH 值较高，通过加入 1% 三氟乙酸将 pH 值调节至 2 以下。将悬浮液在室温下孵育 30 分钟，并在旋转轮上持续轻柔混合。

按照之前的方法离心磁珠后，将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。用移液器吸取20微升乙腈加入C18树脂以活化树脂。去除使用过的乙腈，并重复此活化步骤三次。

然后，用 20 微升 0.1% 三氟乙酸平衡 C18 树脂。去除洗脱液，并重复此平衡步骤三次。加载样品时，使用移液器将样品与树脂结合。

用20微升0.1%三氟乙酸洗涤树脂。重复此步骤五次。用3微升含0.1%三氟乙酸的60%乙腈溶液洗脱样品。

将洗脱液移取至用于MALDI-TOF质谱分析的目标板上。立即加入CHCA溶液，该溶液为在含0.1%三氟乙酸的50%乙腈中饱和的溶液。通过空气干燥使混合物结晶。

根据仪器制造商的方案获取样品的质谱数据，特别关注700至900道尔顿范围内生物素标记底物裂解形式的质谱信号。此处展示了合成底物的质谱图。在850至1,050范围内检测到对应于前体分子量的峰。

切割后的片段在700至850范围内被检测到。图中显示的是经TPCK胰蛋白酶处理的MNO生物素标记底物的质谱图。839.81道尔顿和796.76道尔顿的峰分别对应于从赖氨酸和精氨酸的C末端切割产生的片段。

图中显示了经V8蛋白酶消化的合成底物的质谱图。769.78 道尔顿和 755.62 道尔顿的峰分别对应于从谷氨酸和天冬氨酸的C末端切割产生的片段。此处展示了在不同pH条件下，用肺组织提取物处理的MNO生物素标记底物的质谱图。

在酸性条件（pH 5）下，切割片段的分子量为 770.13 道尔顿和 826.66 道尔顿，表明切割发生在谷氨酸和色氨酸的 C 末端。在中性和碱性条件（pH 7 和 pH 9）下，切割片段的分子量在 767 道尔顿和 840 道尔顿处出现峰值，表明切割发生在精氨酸和赖氨酸的 C 末端。相反，谷氨酸和色氨酸的峰强则降低。

此外，该方法无法检测经失活提取物处理的裂解片段。只要操作得当，除底物合成外，掌握该技术后可在两天内完成。另外，一旦底物合成完成，便可用于多个样品的测定。为什么？

进行该实验操作时，重要的是要记住在缓冲液 pH 值约为 9 的条件下进行。通常，这是亲和素氨基与生物素形成复合物的反应。按照本方法，可通过进行化学发光检测（CMS）来定量酶活性。

该方法将使蛋白质组学领域的研究人员能够探索在多种条件下蛋白酶的表达，从而为相关研究开辟道路。