同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

本方案描述了一种新颖的技术，通过抗体同时富集多种蛋白质翻译后修饰（PTM），随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以获得关于修饰位点定位及修饰间相互作用的生物学见解。该技术具有高效的时间与成本效益，仅需少量样本输入，即可实现对含有乙酰化和琥珀酰化PTM肽段的同步鉴定与定量。追踪翻译后修饰是表征和应对不同疾病状态的重要步骤。

我们已经知道，某些癌症和糖尿病通过这些蛋白质修饰受到高度调控。该方法理论上可应用于任何具有特异性抗体用于富集的蛋白质翻译后修饰，如泛素化、磷酸化等，也可应用于其他组织类型或细胞培养模型。

使用该技术获得有价值数据的关键在于可重复性。为实现这一点，必须确保所有步骤都得到仔细操作，尤其是涉及抗体磁珠的步骤。首先，获取含有C18树脂的色谱柱，其结合的蛋白量最多可达10毫克。

将这些柱芯装入真空装置中。向柱芯中加入 800 µL 含 19.8% 水的 80% 乙腈和 0.2% 甲酸，启动真空抽吸使液体流过柱芯。重复此步骤一次，注意避免柱芯完全干燥。

通过真空抽滤向柱子中加入800微升含0.2%甲酸的水溶液进行平衡，重复两次。将约1,000微升溶液中含有的一毫克肽段通过真空抽滤上样至柱子中。

用800微升含0.2%甲酸的水溶液在真空抽滤下将肽段洗涤两次。然后在每个柱子下方放置1.5毫升微量离心管以收集肽段。在真空抽滤下，先用800微升含80%乙腈、0.2%甲酸的19.8%水溶液从柱子中洗脱肽段，再用400微升相同溶液洗脱。

将脱盐后的肽样品在真空浓缩仪中完全干燥，持续两到三小时。然后，将干燥的肽重新悬浮于1.4毫升冰冷的1×免疫亲和纯化缓冲液中。涡旋混匀，并确保pH值约为7。

在 4 °C 条件下，以 10,000 ×g 离心样品 10 分钟。可见少量沉淀形成。在准备抗体磁珠的同时，将肽置于冰上备用。

向一个含有 100 微升 K-乙酰化抗体珠悬液的离心管和另一个含有 100 微升 K-琥珀酰化抗体珠悬液的离心管中各加入 1 毫升冷的 1× PBS，通过移液混匀。将全部溶液转移至新的 1.5 毫升离心管中，在微型离心机中室温离心 30 秒。吸除 PBS，注意避免吸走任何珠粒。

再重复洗涤三次。接着，将磁珠重悬于约 440 µL 的 PBS 中。用移液器反复吹打数次，以充分混匀。

使用200微升预切枪头，将每种乙酰化赖氨酸抗体磁珠和琥珀酰化赖氨酸抗体磁珠各100微升转移至新离心管中。在微型离心机中离心30秒，用加样枪头吸除上清液。此时磁珠变为白色。

将重悬的多肽直接移液至洗涤后的磁珠上，4摄氏度下振荡孵育过夜。次日早晨，在4摄氏度下以2,000 ×g离心30秒。弃去含有未结合多肽的上清液，如需要可保存用于后续实验。

加入一毫升冰冷的1×免疫亲和纯化缓冲液至珠子中，通过倒置混匀五次进行洗涤。在4°C条件下，以2,000 × g离心30秒。吸除免疫亲和纯化溶液，再重复免疫亲和纯化洗涤步骤一次。

然后向珠子中加入1毫升冷的HPLC水，通过倒置混合五次。在4°C条件下，以2,000 × g离心30秒。吸去水相，并重复水洗步骤额外两次。

在4°C条件下，以2,000 × g再离心30秒，使管底残留的任何液体沉降至管底。使用平头凝胶加样枪头，吸去收集的多余液体。注意避免吸出珠粒。

向珠中加入 55 µL 含 0.15% 三氟乙酸的水溶液。室温孵育珠子 10 分钟，期间偶尔轻敲管底以混匀。在微型离心机中室温离心珠子 30 秒。

使用平头凝胶加样枪头将洗脱的肽段转移至新离心管中。向珠子中加入45 µL含0.15%三氟乙酸的水溶液。室温孵育10分钟，期间偶尔轻弹管底以混匀。

在微型离心机中，室温下以12,000 ×g离心5分钟，使任何残留的微珠沉淀。使用平头凝胶加样吸头移除第二次洗脱液，并与第一次洗脱液合并。将合并后的洗脱肽溶液在室温下于微型离心机中旋转30秒。

将肽段样品溶液转移至新的500微升离心管中。建立上样方法，将富集后的肽段混合物上样至C18预柱芯片，并用流动相A以每分钟2微升的流速冲洗10分钟，再次对肽段进行脱盐。建立色谱方法，使肽段转移至分析柱，并以每分钟300纳升的流速，使用流动相A和B进行2至3小时的梯度洗脱。具体而言，采用线性梯度，使流动相B的比例在80分钟内从5%升至35%。

随后，五分钟内将流动相B线性梯度升至80%，保持80%B八分钟，然后返回至5%B进行25分钟的重新平衡。接下来，建立质谱仪的数据依赖性采集方法。对于实验一，设置MS1母离子扫描范围为质荷比（M/Z）400至1,500。

将时长设置为120分钟。创建一个IDA实验并点击确定。在切换条件选项卡下，将电荷态为2至5的离子触发MS/MS扫描的强度阈值设为每秒200计数。将前体离子的动态排阻时间设为60秒。

对于实验二，设置 MS/MS 产物离子扫描，MS2 扫描范围为 m/z 100 至 1,500。点击编辑参数，将碰撞能量展宽设为 5，并选择高灵敏度产物离子扫描模式。最后，将样品放入自动进样器中。

提交样本队列并启动液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）采集方法，构建用于数据非依赖性采集的质谱仪器方法，并定义两个仪器扫描实验。执行质荷比（m/z）范围为400至1,250的MS1前体离子扫描，持续时间设置为120分钟。将碰撞能量分布设置为10，累积时间设置为45毫秒，然后选择高灵敏度的产物离子扫描模式。

接下来，导入一个包含64个可变窗口DIA SWATH采集方案的文本文件，以将SWATH采集窗口填充至方法中。在此采集方案中，质量电荷比范围从5到90的可变窗口以递增方式覆盖400至1,250的质量电荷比全范围，共分为64个SWATH片段，每个片段的累积时间为45毫秒。将MS1的累积时间调整为0.25秒。

MS1 扫描和 64 次 MS2 扫描的总周期时间现在应为 3.2 秒。本研究的实验结果记录了检测和评估 PTM 串扰的可能性。此表格展示了工作流程的时间线以及所需样品和蛋白质的用量。

与这些替代方法相比，单管法所需时间缩短一半，且样本数量仅需一半。对于修饰肽段面积的变异系数中位数，单管法低于单一PTM富集和连续PTM富集方法。在比较单管PTM与单一PTM富集方法时，两种修饰在位点水平定量的相关性之间未见显著差异。

该图展示了一次成功的富集实验数据，说明了一个含有多种不同酰基化修饰的肽段，用以可视化翻译后修饰之间的相互作用。该肽段在一个赖氨酸残基上发生乙酰化修饰，在另一个赖氨酸残基上发生琥珀酰化修饰；而在此处，同一肽段的两个赖氨酸残基均发生了琥珀酰化修饰。这表明同一个赖氨酸残基可被两种酰基化基团修饰，且该位点可能存在修饰间的相互作用。

必须确保每个样品中含有相同数量的磁珠，并在洗涤肽键磁珠时避免意外吸走磁珠。基于质谱的分析及使用 Spectronaut 等软件工具进行的数据分析均按照此流程进行，以实现对翻译后修饰的鉴定、定量以及修饰位点定位。这种数据非依赖性采集工作流程结合同步的翻译后修饰富集方法，将有助于更高效地评估翻译后修饰间的相互作用，并加深对翻译后修饰信号通路相关性的理解。