回顾性 microRNA 测序：使用福尔马林固定石蜡包埋 RNA 标本的互补 DNA 文库制备方案

构建cDNA文库的总体目标是实现对保存在福尔马林固定石蜡包埋组织中的小RNA进行成功测序。该方法对于分析福尔马林固定石蜡包埋样本非常有用。您可以从最多18个样本中提取RNA，分析所有这些样本的内容，并获得所有样本中全部微小RNA的表达谱。

开始实验方案时，向18份预先分装好的FFPERNA样品中每份加入8.5微升预先配制好的连接反应主混合液。轻轻弹击离心管，短暂离心两秒。离心后，将离心管置于冰上保存。

使用三微升移液器将每种接头各一微升转移至含有 RNA 和连接主混合液的相应 FFPERNA 样品中。不要反复吹打，且在不同 FFPERNA 样品之间需更换吸头。盖紧每个管子，轻轻弹动以混匀，并离心两秒钟。

将离心管置于冰上。将离心管放入90摄氏度的加热块中孵育1分钟以使反应变性，然后立即放回冰上。接着，使用3微升移液器将1微升稀释后的连接酶转移至18个RNA样品中的每一个样品中。

将连接反应置于冰上，然后放入4摄氏度的冷室中，4℃过夜孵育18小时。将离心管置于加热块上，在90摄氏度加热1分钟以终止连接反应，随后放回冰上冷却至少2分钟。向每个离心管中加入1.2 µL的沉淀预混液。

加入 63 µL 的 100% 乙醇。盖紧各管，轻轻弹动试管以混匀，然后离心两秒钟。将试管置于冰上。

将全部18个管中的内容物合并至一个1.5毫升硅化管中，轻轻颠倒混匀三次。离心2秒后，置于冰上60分钟以沉淀。沉淀完成后，对含有混合连接产物的1.5毫升管进行离心。

接下来，使用1毫升移液枪头吸走上清液，但底部需留少量液体。倾斜离心管，用20微升移液枪吸除剩余的上清液。再用带有10微升枪头的巴氏移液管通过真空抽吸除去上清液，然后通过轻弹离心管，将RNA沉淀重悬于20微升无RNase的水中。

加入 20 微升 PAA 上样缓冲液以重悬 RNA。轻弹离心管，于室温下离心 2 秒，然后将离心管置于冰上。将凝胶装置中先前配制的 0.5 XTBE 更换为新鲜的 0.5 XTBE，并将重悬产物、分子量标记物以及连接后的 RNase 加样至凝胶中央，两侧各留两个空孔。

然后运行凝胶电泳。电泳结束后，通过移除其中一块玻璃板来卸下15% PAGE凝胶。将留在玻璃板上的凝胶用10 µL荧光染料溶液和25 mL 0.5× TBE轻轻喷洒，置于黑暗处静置5分钟。

将带有凝胶的玻璃板置于蓝光透射仪上，使用尺子对齐19个核苷酸和24个核苷酸的大小标记，以准确定位连接的小RNA片段并进行切胶。随后，切下目标凝胶区域，并将切下的凝胶置于专用于破碎凝胶片的0.5毫升离心管中，再将该管牢固地插入1.5毫升硅化微量离心管内。

在室温下，以16,000 ×g离心凝胶3分钟。用300微升400毫摩尔氯化钠溶液重悬碎片化凝胶。盖紧管盖，并用石蜡膜密封。

将内容置于4 °C冷室中，以1100 rpm在恒温混匀仪上振荡过夜孵育。次日，从恒温混匀仪中取出离心管，使用1 mL移液器将溶液转移至插入1.5 mL硅化无RNase收集管中的5 µm滤膜管。在室温下以2300 ×g离心3分钟。

弃去滤管，向含有滤液的收集管中加入 950 微升 100% 乙醇，倒置混匀。离心 2 秒，将管置于冰上 60 分钟。然后沉淀 RNA 粒状物。

接下来，打开管盖，用1 mL移液器小心吸除上清液，底部留少量液体。使用20 µL移液器将剩余的上清液完全吸除，注意不要触碰沉淀。倾斜离心管，使残留的液体移至沉淀的对侧。

使用巴斯德移液管吸除上清液，并用真空泵干燥沉淀。将RNA沉淀重悬于5.6 µL无RNase的水中。将逆转录试剂在冰上解冻15分钟。

加入3微升5X缓冲液、4.2微升10X脱氧核苷三磷酸（dioxynucleotide triphosphate，DNTPs）和1.5微升二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）以建立反转录反应体系。轻轻弹击离心管以混匀反应液，离心2秒使溶液沉降至管底。将反应体系置于90摄氏度金属浴中精确加热30秒后，立即转移至50摄氏度恒温混匀仪中孵育2分钟，以平衡温度。

将0.75 µL逆转录酶直接加入溶液中。轻轻振荡混匀，立即将离心管放回50 °C的恒温混匀仪中反应30分钟。30分钟后，将离心管转移至95 °C的加热块中加热1分钟，以终止逆转录反应。

向逆转录反应中直接加入95微升无RNase的水。轻轻弹击离心管以混匀，然后立即置于冰上孵育2分钟。配制初步PCR反应体系，并在热循环仪上设置两个PCR循环。

在热循环仪上设置预实验PCR反应并启动程序一。程序一结束后，使用20微升移液器将12微升预实验PCR反应产物转移至含有3微升5X凝胶上样缓冲液的1.5毫升微量离心管中。通过上下吹打混匀。

并标记为10个循环。关闭试点PCR管，然后在热循环仪上启动程序二。程序二结束后，使用20微升移液器将12微升溶液转移至含有3微升5X凝胶上样染料的1.5毫升微量离心管中，并标记为12个循环。

重复上述步骤，从第14、16、18和20个PCR循环的预实验PCR反应中分别收集12微升PCR产物。然后向每个12微升的PCR等分试样中加入3微升5X凝胶上样染料，同时向含有3微升分子量标记物和9微升无RNase水的20碱基对分子量标记物中也加入3微升5X染料。将样品在含有0.5 XTBE的琼脂糖凝胶上电泳后，置于紫外灯箱中观察凝胶，以确定最佳PCR循环数。

然后为琼脂糖凝胶文库纯化设置大规模PCR反应。PCR扩增后，从每个PCR管中转移九微升至六个含有三微升5X上样缓冲液的1.5毫升微量离心管中。制备一个20个核苷酸的DNA标记物。

将DNA分子量标记、阴性PCR对照以及六个PCR产物上样至琼脂糖凝胶中，在120伏电压下电泳运行30分钟。在紫外成像仪中观察各泳道PCR扩增产物的均一性，并拍照记录。将三管PCR反应产物合并至两支1.5毫升硅化微量离心管中，每管加入27微升5摩尔/升氯化钠溶液和950微升100%乙醇。

将试管倒置混匀，于20摄氏度放置过夜，以沉淀PCR产物。根据该方案，确定了两份新鲜冷冻肿瘤RNA与其相应的特异性FFPE RNA样本之间的微小RNA（micro RNA）表达相关性。配对的新鲜冷冻样本与FFPE样本的微小RNA对比图显示，cDNA文库制备具有良好的可重复性，因为在不同处理方式制备的样本中检测到的微小RNA之间具有高度相关性。

为了确定优化的cDNA文库制备方案是否适用于且可重复地用于年代日益久远的FFPE样本，获取了分别存档18、20、22、27、30和35年的FFPE组织的微小RNA表达谱。无论样本的保存年限或文库制备周次如何，其相关系数均保持在0.96以上。因此，优化后的cDNA文库制备方案为FFPE样本的可重复性分析提供了一种可靠的工具，不受其存档时间的影响。

因此，在观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备小RNA文库，并获得所有珍贵的福尔马林固定及石蜡包埋样本的完整微小RNA表达谱。