大型动物淋巴结的采集与处理以用于RNA分析：为大型动物物种淋巴结转录组学研究做准备

您好，我叫 Dr.Robert Schaut，是位于美国爱荷华州艾姆斯市的国家动物疾病中心的一名科学家。在本 JoVE 视频中，我们将向您介绍如何采集和处理大型动物的淋巴结，以用于后续的 RNA 实验。例如，这些实验可能包括对反转录产物进行定量 PCR，或对转录组进行 RNA 测序研究。

淋巴结是评估宿主免疫反应的有用样本，同时也可以作为病原体RNA的研究来源，例如存在于淋巴结内免疫细胞中的胞内病原体。包括家畜和野生动物在内的大型动物样本，在人畜共患病研究中具有重要意义。在国家动物疾病中心，我们研究家畜感染布鲁氏菌（brucella abortus）的情况，该病原体可导致牛和野牛患布鲁氏菌病，同时也研究牛肠道排出的大肠杆菌O157:H7。

我们还将从野生动物（如鹿和麋鹿）中采集组织样本。可从感染不同疾病的动物体内收集多种淋巴结。对这些自然宿主物种的组织研究通常比小鼠模型更能反映疾病的自然发展过程。

然而，从大型物种采集组织的过程必然比从小鼠采集更为复杂，包括安乐死后到组织收集之间的时间更长，以及淋巴结体积更大。本文将介绍一种用于RNA研究的大型动物淋巴结分离方案，可为从事大型动物感染转录组学研究的分子生物学家以及刚开始开展转录组学研究的兽医研究人员提供参考。在本视频中，我们将以牛的淋巴结为例进行操作演示。

在进行剖检之前，我们建议准备以下专用于组织分离的用品：装有约 1 ml RNA 组织保存液（如 RNAlater）的微量离心管、一次性解剖刀、洁净且经过高压灭菌的镊子、活检针、用于丢弃使用过的解剖刀和针头的锐器盒，以及根据所涉及材料的感染性水平选择使用的砧板或一次性托盘。在本例中，我们将以通常从牛体采集的淋巴结为例，演示该操作的关键步骤。

它们感染了引起布鲁氏菌病的细菌。这些是肩前淋巴结和腮腺淋巴结。在进行大型动物解剖以回收RNA时，最好至少有三名参与者共同处理动物组织。

解剖人员一负责对动物的不同部位进行大体解剖分割，解剖人员二在主解剖台从动物各个部分回收淋巴结，解剖人员三在另一张工作台上处理每个淋巴结，分离其中的组织片段并转移至含有保存液的试管中。我们将首先识别并摘取肩前淋巴结。理想情况下，在解剖前通过触诊淋巴结有助于确定其具体位置。

虽然并非总能检测到，但在健康的动物中，肩前淋巴结通常可触及。首先将动物置于侧卧位，通过在膝关节水平向后移动前肢来伸展肩部。

该动作可使肩部后移，便于轻松触诊淋巴结。按图示方法触摸是否存在淋巴结。一旦确定位置，并保持肩部处于伸展状态，使用解剖刀或手术刀沿肩部轮廓做皮肤切口。

向后牵拉皮肤，以暴露肩部和颈部肌肉组织。有时可见一层皮下脂肪，尤其是在体况过佳的动物中。肩前淋巴结常与皮下脂肪组织相伴存在。

在这里可以看到皮肤、肌肉和皮下脂肪的三层结构。再次触诊淋巴结的位置。与皮下脂肪不同，触诊时淋巴结会保持其原有形状。

找到肩前淋巴结后，仔细分离皮下脂肪，并将淋巴结完整剥离。我们因黄石地区美洲野牛对布鲁氏菌易感，故在布鲁氏菌病研究中使用野牛，其淋巴结外观具有相似性。此处展示的是从一头美洲野牛右肩分离出的肩前淋巴结外观。

接下来，我们将进行腮腺淋巴结的分离。将动物置于侧卧位，定位颞下颌关节。使用手术刀或解剖刀，小心地在皮肤上做切口。

从关节背侧开始，沿下颌线垂直延伸。分离皮肤以暴露皮下组织。腮腺将首先显现，因其体积较大、表面呈分叶状且呈红色。

使用镊子和手术刀将腮腺移开，以找到位于腮腺头侧和内侧的腮腺淋巴结。分离腮腺淋巴结时，关键是要将淋巴结组织与腮腺组织彻底分开。两种组织类型外观不同，组织横切面亦可明显区分。

此处可以观察到左侧的腮腺淋巴结和右侧的腮腺唾液腺。在进一步处理前，务必仔细检查腮腺淋巴结组织的质地。在某些情况下，可能需要切除腮腺唾液腺以定位腮腺淋巴结。

这是一个从公牛身上切除的腮腺示例，其中淋巴结嵌于唾液腺内部，在腺体切除前无法看见。有关选定淋巴结识别的更多信息见主论文。一旦收集完淋巴结，即可准备切取组织片段以进行保存。

使用手术刀或解剖刀，切取一段淋巴结，并做矢状切口以打开淋巴结。检查淋巴结内部，尤其是来自感染动物的样本，观察是否存在不对称、病变、颜色差异等情况。在此牛肩前淋巴结中，多种特征肉眼可见。

这些结构包括含有B淋巴细胞的滤泡，以及含有T细胞的深层皮质区。这些区域看起来比颜色较浅的髓窦颜色更深。此处展示了另一个未感染淋巴结的示例。

该淋巴结来自一头较年轻的野牛。请注意，此样本中的淋巴小结较不明显。为了进行组织切片处理，可选择使用解剖刀从每个淋巴结采集少量组织样本，用于后续RNA提取。

然而，在不同样本之间比较表达谱时，一个主要挑战在于大型动物淋巴结的体积较大，而小鼠淋巴结则较小，可轻易完整取出用于RNA提取。因此，过小的组织切片无法均匀地代表整个淋巴结的细胞分布情况。为了全面获取淋巴结内不同区域的细胞，应从淋巴结中切除一块楔形组织，将其切成厚度不超过5 mm的小块，并用镊子将其放入含有RNAlater的离心管中。

也可采用活检方法从每个淋巴结中切除组织片段。若需采集特定区域（如淋巴结中的特定滤泡），可选择打孔活检工具，然后用镊子将组织转移至RNAlater中。样本转移至RNAlater后，将其送回实验室并在4°C下保存过夜，以确保试剂充分渗透组织。

随后，去除多余的RNAlater，并将组织样本在-80摄氏度保存。使用RNA保存液的一个优点是，在解剖时以及从野外采集样本时均无需液氮。在处理样本前，预先将Trizol试剂分装至用于匀浆的离心管中。

将样品从冷冻机中取出后，应立即根据制造商的建议将其转移至Trizol试剂中进行后续处理。此处，将50–100 mg的组织样本转移至Trizol试剂中。在加入Trizol试剂前，应尽可能避免样本解冻。

当从冷冻机中取出多个样品进行处理时，可使用干冰储存。将离心管置于匀浆器上，用Trizol试剂进行匀浆。此处采用两分钟的RNA提取程序。

完成后，检查是否呈现浑浊外观。如有必要，重复操作。按照生产商的说明书对每个样品分别生成水相和有机相。

用移液枪头去除上层透明的水相，转移至新的微量离心管中。接着，加入等体积的100%乙醇混匀。

充分混匀。试管中常出现浑浊现象。使用微量移液器吸头将液体转移至基于硅胶的商用离心柱中，以进一步纯化RNA，随后洗脱RNA。

为评估RNA质量，取1至2 µL洗脱的RNA样品加入分光光度计进行分析。完成操作后，我们观察到260-280和260-230的吸光度比值均约为2，表明RNA纯度较高，化学残留极少。若存在苯酚污染，则260-230 nm吸光度比值会降低，可通过该现象加以识别。

在对野牛等动物进行尸体解剖时，我们观察到从实施安乐死后到将第一个组织样本转移至保存液之间，至少存在20分钟的时间间隔。相比之下，小鼠的淋巴结可在安乐死后数分钟内完成摘除并保存。因此，我们希望研究淋巴结随时间推移的降解过程。

在主论文中，我们还汇总了其他已发表研究中检测过的多种组织类型的RNA稳定性特征。在以美洲野牛淋巴结进行的代表性实验中，安乐死后1小时内RNA稳定性相对保持一致。此处展示了从美洲野牛乳房上淋巴结组织样本中提取的总RNA的凝胶图像。

这一发现与文献中汇总的其他组织类型先前的数据一致。这表明，即使是从野牛和麋鹿等较难处理的物种中，也能采集到可用于基因表达下游分析的合格质量样本。然而需要注意的是，死亡与样本保存之间的时间越长，可能导致RNA表达谱发生变化，包括mRNA转录本3'端降解程度增加。

因此，在动物可供解剖后，仍需采用快速、简化的组织回收流程，以尽量减少进一步的延迟，从而获得最具生物学有效性的RNA图谱。此外，我们注意到，整个操作过程中必须格外注意，避免在已存在于组织中的RNA污染物之外，将新的RNA污染物引入样品中。这包括在使用其他必要的个人防护装备时，同时佩戴手套。

我们还将最终的RNA产物分装至多个试管中，以尽可能减少RNA样本的反复冻融。例如，可将不同分装样品分别保存用于质量控制检测。总之，在本视频中，我们提供了有关淋巴结的鉴定、采集、代表性取样及后续基因表达分析处理的重要信息。

尽管我们的示范视频以牛和野牛为例进行展示，但我们同样处理过其他大型动物物种的淋巴结，包括山羊和麋鹿。无论您是考虑在研究中应用转录组学方法的兽医科学家，还是有意涉足大型动物科学研究领域的分子生物学家，我们都希望本视频能对您的工作有所帮助。