分裂型BioID——在天然细胞环境中对特定情境下蛋白质复合物的蛋白质组学分析

本实验的总体目标是利用分裂型BioID（split-BioID）技术，研究在一对特定相互作用的目标蛋白周围组装形成的蛋白质复合物的组成。分裂型BioID是一种蛋白质片段互补检测方法，可在活细胞内诱导依赖于邻近关系的蛋白质生物素标记。该方法有助于回答细胞生物学中的关键问题，例如蛋白质复合物如何动态重塑以调控不同的细胞功能。该技术的主要优势在于，能够在天然细胞环境中以极高的分辨率，简便地鉴定出具有特定生物学背景的蛋白质复合物。

进行最终的质谱分析时，以下步骤需在无角蛋白条件下操作，所有材料和试剂应尽可能无角蛋白。将两个目的蛋白的ORF克隆至分裂型BioID质粒中，按照文本方案进行瞬时转染并加入含生物素的培养基后，用PBS洗涤细胞两次。每孔加入1.5毫升PBS，用细胞刮刀收集细胞，然后将每种条件下的细胞分别转移至独立的15毫升离心管中，在4摄氏度、1,200 ×g 条件下离心5分钟。

弃去上清液，并将沉淀物在液氮中速冻。随后将试管置于负80摄氏度保存，直至进一步处理。制备细胞裂解液时，使用1毫升室温裂解缓冲液重悬沉淀物。

然后用25号针头将细胞反复吹打10至20次。接着对样品进行超声处理。然后每900 µL收集的超声裂解液中加入100 µL 20% Triton X-100，使终浓度为2%。每毫升裂解液中加入2.3 mL 50 mmol/L Tris（pH 7.4），以调节NaCl浓度至150 mmol/L，用于与链霉亲和素磁珠结合。

然后将调整后的裂解液分装至1.5毫升离心管中，在4°C条件下以16,000 × g离心10分钟。将上清液转移至15毫升离心管中，并保留50至100微升作为输入样品。进行链霉亲和素pull-down实验时，每种条件下将200微升链霉亲和素偶联磁珠悬浮液转移至1.5毫升离心管中。

将离心管置于磁力架上，静置约一分钟，然后移除保存缓冲液。用一毫升平衡缓冲液轻轻混匀以洗涤磁珠。随后将平衡后的磁珠均匀分装至所需数量的离心管中，并重新放回磁力架上。

除去平衡缓冲液后，将每组磁珠用等量的相应细胞裂解液重悬。然后在4°C条件下于旋转仪上孵育样品过夜。次日，将离心管置于磁力架上。

等待磁珠吸附到管壁一侧后，将上清液转移至标记为“流穿液”的15毫升离心管中。用200微升洗涤缓冲液一重悬各管中的磁珠，并将对应同一条件的磁珠悬液合并至1.5毫升离心管中。用1毫升洗涤缓冲液一在旋转仪上洗涤磁珠两次，每次8分钟。

然后分别用洗涤缓冲液二、三和四各洗涤两次。为确保最后一次洗涤后完全去除洗涤缓冲液，在移除大部分上清液后，将样品离心沉淀。随后将样品放回磁力架上，去除残留的缓冲液。

向珠子中加入30 µL洗脱缓冲液，然后将样品在98 °C孵育15分钟，并立即将试管转移至磁力架上。将洗脱的样品转移至新的离心管中，并在-20 °C保存，直至后续处理。对于每个输入样品，通过将等量蛋白质与适当体积的3X SDS上样缓冲液混合，制备总体积为28 µL的PAGE样品。

然后，将每个洗脱样品的5微升与2.5微升3X SDS上样缓冲液混合，制备PAGE样品。将样品上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，随后按照文本方案进行电泳和蛋白质印迹分析。

为进行质谱分析的SDS-PAGE，向每份18.75微升的洗脱样品中加入6.25微升4X上样缓冲液，并将样品上样至4%至20%预制SDS凝胶中，电泳至样品进入凝胶2至3厘米处。在15厘米的培养皿中，使用胶体考马斯亮蓝G250染色液对凝胶进行染色。使用洁净的手术刀切下每个样品的整条泳道（排除链霉亲和素条带），并将切下的条带转移至1.5毫升离心管中用于质谱分析。

除了在 BioID 或 split-BioID 实验中鉴定出的内源性生物素化蛋白外，通过 Western 印迹检测到的其他主要条带是发生自生物素化的融合蛋白，这表明在此示例中，Ago2 与 TNRC6C 或 Ago2 与 Dicer 这两对被检测蛋白在细胞内发生了相互作用。此外，Western 印迹结果还表明，将 NBirA*Ago2 融合蛋白与 CBirA*TNRC6C 或 CBirA*Dicer 融合蛋白配对，比相反组合（即 CBirA*Ago2 与 NBirA*TNRC6C 或 NBirA*Dicer 配对）更为高效。此外，该激活具有特异性，因为任何 CBirA* 融合蛋白均无法将 NBirA*GFP 对照融合蛋白显著激活。

首次进行分离操作时，应通过蛋白质印迹法分析纯化的所有步骤。如图所示，目标蛋白与磁珠的结合应接近定量，且在洗涤步骤中几乎不应观察到穿透现象。在蛋白表达并诱导生物素化后，将洗脱产物上样至考马斯亮蓝染色凝胶进行电泳，所观察到的最强条带大小约为17千道尔顿，对应于单体链霉亲和素。

通常将链霉亲和素条带至加样孔之间样品泳道的区域切下，用于质谱分析。在将该方法应用于两种特定蛋白质时，重要的是要测试不同组合的融合蛋白。我们经常观察到，整体生物素化效率在很大程度上取决于哪种蛋白质连接至N端或C端BirA片段。

同样重要的是，在分裂型BioID实验中至少加入一个阴性对照。例如，使用一对与目标蛋白对无关的相互作用蛋白进行实验。在完成本实验步骤及质谱分析后，应通过计算分析将鉴定出的肽段与阴性对照实验进行比对评分。

例如，我们使用由德国慕尼黑的 Cox 和 Mann 实验室开发的 MaxQuant 和 Perseus 软件。