利用肾脏注射法在小型鱼类循环系统中简便高效地施用和可视化微粒

本实验的总体目标是演示一种通过向成年斑马鱼肾脏注射将微粒引入其循环系统的技术。通过一种简单的体内成像技术对斑马鱼鳃部进行观察，可进一步在血管系统中可视化这些引入的微粒。例如，该方法可用于通过引入包埋型荧光pH探针，在活体条件下对斑马鱼血液pH值进行重复测量。

为此，首先采用逐层自组装方法，将与葡聚糖结合的pH敏感性染料SNARF-1包封在半透性聚电解质壳内。将荧光染料共沉淀至多孔的碳酸钙微核中，随后在微核表面交替包覆多层带相反电荷的非生物降解性聚合物，并在外层涂覆含有聚乙二醇的生物相容性聚合物。接着，溶解碳酸钙微核，从而获得完整包封SNARF-1的微胶囊。

在鱼类麻醉与固定的第二阶段，将制备好的微胶囊直接注射到动物的肾脏中，以将包封的染料递送至鱼类的循环系统。接下来，需进行最小程度的手术以移除鳃盖，并暴露鱼鳃毛细血管。随后，可通过活体显微镜在体实时观察血液中的微胶囊，并记录荧光光谱，以监测血液pH值。

当注射操作正确时，可在操作后立即观察到鱼鳃中的荧光微胶囊。可通过与荧光显微镜联用的光谱仪记录包封探针的荧光光谱。SNARF-1 具有两个发射峰，利用对应这两个峰的波长比值可测定 pH 值。

该方案可将荧光微胶囊递送至鱼类循环系统，并远程监测活体鱼类血液中的荧光信号。在生理学研究中，该方法的主要优势在于能够对小型实验动物进行多次重复的血液参数测量，而这类操作通常难以实现。若使用光敏性荧光探针，建议在避光环境中进行整个操作过程。

在快速搅拌下，将2毫升选定的聚合物结合荧光染料（此处为SNARF-1-葡聚糖）溶液与0.6毫升1摩尔的氯化钙溶液和0.6毫升1摩尔的碳酸钠溶液混合。在此步骤中，合成包封荧光染料的多孔碳酸钙微核。振荡5至10秒后，将悬浮液转移至2毫升微量离心管中，离心15秒，使碳酸钙微核沉淀。

弃去上清液，用约两毫升去离子水洗涤微核，振荡重悬。重复离心和洗涤步骤三次。将悬浮液置于超声波水浴中孵育一分钟，以减少微核的聚集。

将碳酸钙微核重悬于约两毫升浓度为每毫升四微克的阳离子聚合物PAH溶液中，以在模板上沉积第一层聚合物。将微核置于该pH溶液中，持续振荡约五分钟。经过15秒离心后，弃去含有未结合PAH的上清液，并通过多次离心和洗涤步骤，用纯水洗涤微核三次。

用4毫克/毫升的阴离子聚合物PSS溶液重复上述步骤，以在模板上沉积第二层聚合物层。在添加下一层之前，建议在超声波浴中孵育1分钟。依次重复阳离子和阴离子聚合物的沉积过程六次，以获得具有12层结构的微胶囊壳。

接下来，将带有外壳的微核与聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸在室温下孵育至少两小时。然后，通过连续的离心和重悬步骤，用纯水洗涤包被后的微核一次。最后，将碳酸钙模板溶解于2毫升浓度为0.1摩尔的EDTA溶液中（pH值调节至约7.1），以获得中空微胶囊。

45秒离心后弃去上清液，用EDTA洗涤两次。45秒离心后弃去上清液，加入2毫升生理盐水。用生理盐水重复离心洗涤步骤三次。

在荧光显微镜下使用血细胞计数板检测所制备微胶囊的粒径分布和浓度。使用 ImageJ 或同等软件对颗粒进行粒径分析。将获得的包封探针避光保存。

准备光学系统时，根据所用荧光染料的特性，将相应的荧光滤光片组安装到荧光显微镜上，并打开荧光灯。将杠杆拉出至目镜端。将光纤一端连接到光谱仪，另一端连接到准直器。

使用适配器，将准直器安装在荧光显微镜的相机筒或其他可用端口的焦平面上。为校准制备好的微胶囊，取约五微升微胶囊悬浮液滴加到显微镜载玻片上，并在避光处干燥液滴。打开光谱仪。

运行光谱仪控制程序，并准备光谱仪以进行测量。为校准微胶囊化SNARF-1的光谱特性，使用一系列不同pH值的缓冲液。将约10微升的钠缓冲液滴加到含有SNARF-1的干燥微胶囊上，并盖上盖玻片。

将载玻片放置在显微镜载物台上。使用约400倍的放大倍数定位微胶囊。将显微镜的杠杆切换至相机端口。

使用光谱仪记录荧光信号。确保光谱信号远高于背景水平，并观察微胶囊是否未处于气泡中。避免对同一微胶囊长时间照射，因为SNARF-1对光漂白敏感。

将杠杆转回目镜位置。计算封装的SNARF-1在质子化与去质子化染料发射峰波长处的荧光强度比值。根据该比值与介质pH值的依赖关系，绘制校准曲线。

从安乐死的鱼类中采集约10微升血液。使用微电极通过pH计测定其pH值。然后将血液滴加到载玻片上含有干燥微胶囊的区域，并按照校准缓冲液的方法记录荧光强度的比值。

由于需要考虑血液成分对包埋的SNARF-1检测信号的影响，应调整校准曲线的线性系数，使曲线与鱼血中的测量值相匹配。准备注射用针头时，用锋利的穿刺针去除胰岛素注射器前端的塑料部分，取出钢针。将该钢针插入玻璃微毛细管中至一半深度。

使用燃气火炬快速而轻柔地进行焊接。将玻璃微毛细管连接至显微注射器，并用无菌水冲洗三次。确保液体能够顺利通过针头。

用水填充系统，确保系统内无气泡。在实验当天，取已制备的微胶囊悬浮液，该悬浮液为含有无菌生理盐水的溶液，每微升含五十万至六百万个微胶囊。

使用超声波清洗仪重悬1分钟。在后续注射过程中，定期振荡小瓶以重新悬浮微胶囊，防止其聚集。用勺子将鱼从麻醉液中取出，轻轻将其侧向放置在湿润的海绵上，若为右手操作则鱼头朝左，若为左手操作则鱼头朝右。

注射前，用连接显微注射仪的玻璃毛细管吸入一到两毫米的空气。然后，加入约两微升分散的微胶囊。用非惯用手轻轻将鱼体固定在海绵上。

找到鱼的侧线。将针头置于侧线腹部节段中点下方一毫升处。然后，通过刮擦动作将鱼鳞拨开，进行穿刺。

将针头以与台面成45度角的方向插入动物体内。推动针头朝向脊柱，直至其轻轻接触脊柱。然后，缓慢向肾脏内注入约一微升的微胶囊悬浮液，并缓慢撤出针头。

用流水从头部到尾部冲洗鱼类，以清除注射部位溢出的微胶囊。使用解剖剪去除鱼头的鳃盖，暴露鱼鳃。用水冲洗鳃部。

使用勺子将鱼转移到显微镜载玻片上，并将其置于荧光显微镜的载物台上。进行以下操作时，务必确保鱼的鳃部不干燥。为此，需定期使用巴斯德移液管加水润湿鳃部。

将房间变暗，使用低倍镜观察鳃部以寻找发出荧光的微胶囊。找到后，切换至高倍镜，并将目标移至视野中央。转动转接杆，使光路连接至光谱仪所在的端口。

记录光谱信号。将杠杆转回目镜位置。对不同的微胶囊重复测量多次。

将鱼转移至具有适当通气条件的水族箱中以恢复。通过重复使用麻醉剂或其它固定方法，可对同一个体进行多次测量。图中显示了利用包埋型荧光染料SNARF-1对斑马鱼血液及高碳酸血症进行活体测量的代表性示例。

在对照条件下，注射微胶囊后四小时内血液 pH 值保持稳定，而暴露于高浓度二氧化碳五分钟则会导致鱼血酸化。操作过程中，应尽量减少因操作和手术给动物带来的应激反应。经过一定练习后，注射和信号记录平均仅需两到三分钟，因此本方案可在鱼类从轻度麻醉中苏醒前完成所有操作。

在操作过程中，务必始终保持鱼类的鳃部湿润。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在小型鱼类的循环系统中进行简单而有效的微粒植入。如视频所示，该技术非常适用于利用装载荧光探针的微胶囊对成年斑马鱼进行重复的活体血液 pH 值记录。