利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

研究神经元形态发生需要对单个细胞的树突或轴突进行标记和可视化。通过以最小侵入性方式标记正在发育的树突或轴突，视网膜组织可保持健康状态，适合长时间共聚焦活体成像。该方法的主要优势在于，注射后四天内即可利用多种荧光蛋白对单个树突或轴突进行可视化观察。

这使得研究新生期神经元树突形态成为可能。该注射成像与分析方案可用于研究中枢神经系统中各类神经元的形态结构。必须根据目标细胞群体选择合适的Cre工具小鼠品系及注射位点。

首先选择一种Cre小鼠品系，以标记目标视网膜细胞群体。获取编码荧光蛋白的重组酶依赖型AAV病毒。为了实现对细微突起的最优标记，应选择表达靶向细胞膜的修饰型荧光蛋白的载体。

将AAV分装样品置于冰上，并使用无菌生理盐水或PBS制备1至4倍的AAV稀释液。为便于观察注射过程，可在每15微升AAV稀释液中加入约1微升0.02%的快绿FCF（Fast Green FCF）染料溶液，使溶液呈现蓝色。用70%乙醇对注射区域进行消毒。

使用微量注射器将 AAV 稀释液回填至微量移液管中。在体视显微镜下，用 30 号针头轻折微量移液管尖端以打开封口。麻醉新生小鼠后，用 30 号针头将纹身墨水注入其足垫进行个体标记。

采集尾部组织样本用于DNA提取和基因分型。用70%乙醇擦拭覆盖眼睛的皮肤。使用30号针头切开融合的眼睑，同时用手指轻轻按压以打开眼睛。

在角膜与巩膜交界处的角膜上刺一个小孔。将玻璃微量移液管插入孔中，并踩下微注射仪脚踏开关两到四次，将AAV注入玻璃体腔。缓慢取出微量移液管，并通过观察瞳孔内的蓝色染料确认AAV注射成功。

按照文稿中所述方法配制视网膜 aCSF 后，使用碳氧混合气体（carbogen）鼓泡至少 15 分钟以对其进行氧合，然后将 pH 值调节至 7.4。将一个直径为 60 毫米的培养皿嵌入冰盘中，并加入氧合后的视网膜 aCSF。将盛有溶液的培养皿置于体视显微镜下。

接下来，剪开已处死小鼠的眼睑瓣以暴露眼球。用钝头镊子摘除眼球，并将其转移至体视显微镜下盛有冷视网膜aCSF的容器中。在体视显微镜下，用Dumont #5镊子夹住视神经固定眼球，然后用30号针头在角膜中央刺一个小孔，再将显微剪的一侧刀尖插入小孔，从孔处沿角膜剪至角膜边缘。

重复操作，在四个正方向上制作四个切口，形成四个瓣膜。用镊子夹住并拉开两个相邻的瓣膜，轻轻将巩膜从视网膜上剥离，完成所有角膜瓣的分离。然后用镊子从视网膜杯中取出晶状体。

最后，使用显微剪刀从视网膜边缘向视神经方向做四个放射状切口，形成四个相等的瓣片。如果使用大直径的灰色MCE膜滤器进行封片，将圆盘切成大约一厘米宽的四个象限，然后将MCE圆盘置于较大白色滤纸的中央。使用两把3/0号画笔，将一个视网膜杯用画笔翻转，使视网膜神经节细胞侧朝下。

轻轻将视网膜从aCSF中提起，确保表面张力不会撕裂视网膜。在仍用画笔夹持视网膜的同时，移开盛有aCSF的培养皿，将带有MCE膜的白色滤纸置于体视显微镜下。使用移液器，在MCE滤纸中央滴加一滴aCSF。

利用表面张力和带电的MCE膜形成的aCSF液滴使视网膜漂浮其中。使用画笔将视网膜调整至液滴内，确保视网膜神经节细胞侧朝上，然后展开四个瓣膜。定位完成后，用画笔与白色滤纸之间形成水桥，以打破液滴的表面张力。

组装活体成像培养室，并加入充氧的人工脑脊液（aCSF）。打开泵和温度控制器，确保温度不超过34摄氏度。培养室温度可能需要长达一小时才能稳定。

建议在开始视网膜分离之前先设置好孵育腔。稳定的腔体温度有助于减少样本漂移。将视网膜平铺组织转移至灌流腔时，应停止泵液并移除腔内的 aCSF。

然后将带有视网膜平铺片的MCE圆盘放入孵育 chamber 中。用液体预湿样品压片以破坏表面张力，随后将其放置在平铺样本上，确保样品压片置于MCE滤纸上，以减少样本漂移。重新向 chamber 中加入预热的aCSF，并以约1毫升/分钟的速度循环灌注aCSF。

将物镜转至25倍水浸物镜位置，插入成像室。使用落射荧光光源筛选标记的目标细胞，并调节成像范围以捕获感兴趣的目标树突结构。利用可识别过饱和与欠饱和像素的查找表，调节激光功率，确保无任何像素过饱和。

获取三维成像体积，并以所需的帧率重复采集。可在每个时间点之间调整成像体积，以补偿样品漂移。导入图像序列，并按时间对图像进行分割。

手动保存所有时间点，或通过运行宏插件进行保存。使用 ImageJ 插件创建理论点扩散函数：单击“Defraction PSF 3D”，需要输入物镜数值孔径、荧光染料发射波长、像素大小和 Z 轴间距，以生成准确的点扩散函数。选择插件、宏，然后运行所提供的宏，对所有时间点执行批量并行迭代去卷积。

通过点击文件、导入，然后选择图像序列，将所有去卷积后的时间点作为图像栈导入。通过点击图像、超栈，然后选择图像栈转超栈，将图像栈转换为超栈。输入Z切片数和时间帧数，然后使用校正3D漂移插件校正三维漂移。

保存经三维漂移校正的超堆栈，并通过点击图像、超堆栈、超堆栈转堆栈，将图像转换回普通堆栈，然后通过点击图像、堆栈、工具和堆栈拆分器来拆分时间点。在“要拆分的子堆栈数量”中输入时间点的数量。使用批处理为所有时间点创建最大强度投影。

通过点击文件、导入，然后选择图像序列，来导入延时图像序列。使用常规的 ImageJ 工具对去卷积并后处理后的二维视频进行所需的分析。获取了发育中星爆细胞树突的高分辨率三维视频，并对其进行去卷积处理以及三维漂移校正。生成了Z平面最大投影，以制作用于分析的二维视频，显示树突精细化区域和树突向外生长区域。

每个时间点的3D去卷积处理提高了单个P6星形无长突细胞在去卷积前后的细小丝状伪足突起的分辨率，该处理使用ImageJ完成。延长AAV感染时间并不一定会增强荧光信号，因为在注射后5天和11天时蛋白质表达水平相似。在成像过程中减少样品漂移非常重要。

通过保持成像温度恒定以及在样品上适当放置配重，可最大限度减少漂移。如果发生漂移，可通过手动采集时间序列，在各帧之间调整成像体积，从而确保目标特征始终保持在视野范围内。

本方案可生成高分辨率、去卷积且漂移校正的神经突起发育三维视频。此类视频有助于更好地理解神经元的连接方式，并且对于推进三维形态发生计算分析方法至关重要。要实现对神经突起发育的高通量分析，需要更优的自动追踪和跟踪软件。