上皮细胞重植及啮齿类动物肾脏组织发育用细胞外基质支架的制备

本实验的总体目标是利用人肾上皮细胞重新定植无细胞三维啮齿类动物肾脏细胞外基质支架。该过程首先通过肾动脉持续灌注一系列去污剂溶液，历时26小时，对哈瓦那大鼠肾脏进行脱细胞处理。随后对肾脏进行灭菌，并在定制设计的生物反应器系统中，通过持续顺行性动脉灌注，将4000万个人肾皮质小管上皮细胞（RCTE细胞）注入无细胞肾脏细胞外基质支架中。

最终，可通过内质网和灌注实验以及免疫组织化学分析来评估RTE细胞重建肾脏支架的能力。这种三维细胞培养技术可使研究人员对整个器官的细胞外基质进行细胞重植。支架中的细胞被沉积于细胞外基质的管周间隙内，从而便于研究影响细胞生长、分化和成熟的结合因子。

与合成聚合物支架等替代方法相比，该技术的主要优势在于肾脏细胞外基质能够在由天然结构蛋白、生长因子及其他生物组分构成的复杂网络中，促进灌注细胞的黏附、增殖和成熟。开始脱细胞过程时，将每个解冻肾脏的肾动脉导管连接至泵下游灌注回路管路的末端，确保导管内无气泡滞留。若导管中存在气泡，使用200微升微量移液器将气泡抽出，并用液体充满导管。

将肾脏悬挂在一只空的五升烧杯内壁上，确保肾动脉不发生扭曲或盘绕，并将泵驱动速率调节至每分钟五毫升。然后确认每个肾脏均有溶液从器官底部滴下，表明灌注正在进行，随后按下启动按钮，并根据灌注流程图所示，向每个肾脏加入相应的溶液。将脱细胞肾脏储存在含有 PBS 的 50 毫升锥形管中，置于四摄氏度，最长不超过两天。在组装好灌注回路后，取下生物反应器头部的红色螺帽，通过开口用移液器向培养基储液罐中加入 50 毫升含 0.1% 过乙酸和 4% 乙醇的溶液。

使用一个大容量泵筒，将蠕动泵管段连接到泵头。然后将流速调节至每分钟五毫升。按下启动按钮，当液体充满灌注管路并到达三通旋塞的另一个开放端口时，使管路系统完成预充。

使用雄性接头堵住端口。让灌注回路完全预充，直至灌注管路或入口内侧无气泡可见。通过暂时提高泵的流速，使接头接受端排出灌注回路中的气泡。

当系统完全预充后，停止泵驱动，并对六英寸镊子进行灭菌。小心地将肾动脉导管的雌性接头端插入生物反应器盖内表面的雄性入口、接头受体中，确保连接紧密且导管内无残留空气。让肾脏自然垂挂在肾动脉导管上，避免肾动脉发生扭转或弯曲。

然后拧紧固定生物反应器头部与主体的金属夹，使生物反应器储液罐紧密密封，并关闭螺旋盖。现在以每分钟5 mL的流速，用室温的过氧乙酸乙醇溶液对肾脏进行灌注灭菌。一小时后，停止泵运行并打开红色螺旋盖。

使用无菌移液器，小心吸取生物反应器储液槽中的全部溶液。然后向生物反应器储液槽中加入50毫升新鲜的PBS。拧紧螺口盖，并在室温下以每分钟5毫升的流速启动泵，进行三次连续的一小时灌注。

最后一次 PBS 冲洗后，吸出储液槽中的盐水，并向储液槽中加入 50 毫升培养基，拧紧螺旋盖。将连接灌注回路的生物反应器转移至 37 摄氏度、5% 二氧化碳的大型培养箱中。然后将生物反应器的灌注回路连接至泵，以每分钟 4 毫升的速度对肾脏进行灌注，接种前至少持续灌注一小时。

为了进行细胞化，肾脏需要收集足够数量的培养瓶，以达到所需的接种浓度。接下来，在从每个培养瓶中吸除培养基后，使用10毫升适当的细胞解离酶，在37°C条件下将肾皮质小管上皮细胞从培养瓶中消化下来。10分钟后，开始每2分钟在相差显微镜下检查一次培养瓶，直至观察到细胞成片脱落。

然后取少量细胞样品进行计数后，将相应的细胞悬液用等体积的预温培养基稀释，并离心细胞悬液。用适量的培养基重悬沉淀，以获得每毫升含两乘以十的七次方个细胞的终浓度。取2毫升该细胞悬液加入35毫米的培养皿中，再用无菌的5毫升注射器吸取2毫升该悬液。

将灌注生物反应器转移至生物安全柜中，并转动旋塞阀以关闭流向接口端口的液体流动。取下旋塞阀的公端接头堵头，连接注射器。然后迅速将灌注回路重新转移回培养箱，并使用大泵筒将蠕动泵管段固定在泵头上，以使细胞就位。

关闭朝向泵的旋塞阀端口，缓慢将细胞注入肾脏支架中。然后旋转旋塞阀，关闭来自注射器的液体流动，并以每分钟25毫升的流速启动泵。15分钟后，将泵的流速降低至每分钟4毫升，次日更换培养基，之后每两天更换一次。

为评估细胞的活力与增殖情况，需在恰好一小时后，无菌地将培养基更换为10毫升扎林工作液，以每分钟4毫升的流速对肾支架进行灌注。收集已使用且部分还原的扎林溶液后，再进行一次每分钟4毫升的灌注。使用100毫升新鲜培养基，经水和稀释洗涤剂溶液依次灌注的肾脏在26小时期间内逐渐变得透明；至最终洗涤剂灌注阶段，肾脏的血管网络，特别是叶间血管，在脱细胞支架中清晰可见。整个器官的天然细胞已被完全清除，仅留下完整的肾小球、肾小管和集合管的基底膜网络，以及脱细胞化血管的细胞外基质。

除了较大的血管外，肾小球内的微血管基底膜也保持其结构完整性。如前所述，接种到肾脏支架中的 RCTE 细胞主要归巢至肾脏支架的皮质区域，并优先重定植于肾小球周围的小管。接种后第 1 天，仅有少量细胞嵌入肾小球内；而到第 7 天时，肾小球几乎无细胞存在，而大部分细胞占据肾脏细胞外基质的皮质区域。

经过七天的顺行灌注培养后，在肾小管上皮细胞（RCTE）接种并进行一周灌注培养后，许多 RCTE 细胞系的管状结构已出现在外髓质和乳头区的肾小管及集合管中。然而，脱细胞后所呈现的透明外观已消失，重构的肾脏呈现出不透明状态，外观更接近天然肾脏。在此步骤完成后，可进一步采用其他方法，如对条件培养基进行生化或免疫化学分析，以回答更多科学问题，例如：这些细胞在肾脏细胞外基质中的代谢状态或表型特征发生了怎样的变化？

开发细胞外支架并将供体细胞重新植入基质的能力，使研究人员能够在天然肾组织脱细胞基质支架中阐明细胞的三维生长与成熟过程。该技术的最终目标是将其作为一种工具，以更深入地理解肾脏修复与再生的机制。