一种基于流式细胞术的检测方法，用于测量缺氧/复氧后心肌细胞线粒体膜电位

该方法可用于检测缺氧/复氧对细胞线粒体膜电位的影响，并可用于评估某种试剂是否对损伤具有保护作用。该检测方法的主要优势在于，其所检测的线粒体膜电位（MMP）不受线粒体大小等因素的影响。此外，该方法对材料和仪器的要求较低。

从六孔板中处于70%融合度的人类心肌细胞开始。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞后，在2毫升无血清且无葡萄糖的DMEM中加入药物或对照溶剂。在缺氧处理前，将细胞置于含5% CO₂和95%空气的细胞培养箱中，37摄氏度孵育30分钟。

30分钟后，将人源心肌细胞培养皿放入2.5升密闭无氧罐中。罐内装有可清除游离氧的催化剂以及用于测定培养基中氧张力的厌氧指示剂。将该罐置于组织培养孵育箱中。

在常氧环境中，厌氧指示剂的颜色为浅蓝色，而在缺氧条件下则变为淡白色。通过将六孔板从厌氧罐中取出并放置于培养箱的架子上两小时，使人心肌细胞复氧。复氧后，用一毫升预热的PBS冲洗细胞，并沿孔壁加入0.5毫升预热的25%胰蛋白酶。

在37摄氏度孵育约一分钟，直至所有人的心肌细胞几乎完全脱落。然后向孔中加入1毫升完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在室温下以500 × g离心3分钟，沉淀人的心肌细胞（HCMs）。

离心后，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。然后向每管中加入5毫升人源心肌细胞完全培养基和5毫升JC-1工作液。通过反复吹打重悬人源心肌细胞（HCMs）。

用铝箔覆盖试管，以防止荧光指示剂褪色，并将细胞在正常条件下孵育 20 分钟。在 4°C 预冷的离心机中，以 500 × g 离心 3 分钟沉淀人源心肌细胞后，用 2 毫升冰浴的 JC-1 染色缓冲液洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将人源心肌细胞重悬于 300 微升冰浴的染色缓冲液中。

将样品过滤至相应的样品管中。在30分钟内通过流式细胞术分析细胞。启动流式细胞仪，并确保软件已连接。

进行流体启动。启动液流，并调节液滴分离。在流式细胞术软件中打开两个散点图窗口。

在第一个点图中，选择前向散射光作为X轴，侧向散射光作为Y轴，分别用于表示细胞的大小和颗粒度特征。Y轴选择PE检测通道。

第二个点图中，X轴采用对数尺度表示FITC，用于检测细胞中JC-1染料的荧光强度。点击“卸载”以释放管架臂，并将未用JC-1染色的人类心肌细胞空白样品管置于检测位置，然后点击“加载”使管架臂回到工作位置。

单击“记录”以从空白样品管中的悬浮液收集颗粒。在第二个散点图中调整荧光通道的电压。在第一个散点图中圈选细胞群体以进行后续分析。

接下来，分析人源心肌细胞。显示每个样本管的统计结果，并通过将红色荧光强度与绿色荧光强度的比值相除，计算各样本的线粒体膜电位（MMP）。与正常细胞相比，缺氧和复氧显著诱导人源心肌细胞发生凋亡，该结果通过Annexin PI比值测定。

一种具有心脏保护作用的中药，在缺氧/复氧后抑制了人心肌细胞的凋亡。如图所示，经线粒体CCP处理后，JC-1红/绿荧光比值几乎为零，这与细胞凋亡实验的结果一致。

H/R 处理组的红/绿荧光比值显著低于正常组，并逆转了该比值的变化。在进行此操作时，需注意应将负载 JC-1 的细胞起始于冰上预冷的静置缓冲液中，因为温度对线粒体膜电位的稳定性具有显著影响。

采用此方法后，还可进行其他实验操作，例如基因操作，以回答更多科学问题，如基质金属蛋白酶（MMP）活性的降低是否由线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放所引起。