人类诱导多能干细胞及其神经和胶质分化衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

本方案为科研人员提供了一种强大的工具，可在单细胞水平上整合人类诱导多能干细胞（iPS）及其神经和非神经分化衍生物的多种微参数。该方案允许利用流式细胞术在整体水平以及每单位线粒体体积的特异性水平上，对线粒体参数进行联合分析。该技术可应用于多种细胞类型，包括其他神经退行性疾病来源的细胞。

因此，这有助于揭示这些疾病类型的潜在机制，并可能辅助治疗药物的筛选。首先，将细胞分别接种到六孔板中的四个孔内，培养细胞直至达到50%至60%的融合度。培养结束后，配制五种不同的染色溶液，每种溶液含有培养基、FCCP、TMRE、MTG和mito sock spread的不同组合。

将它们加入相应的孔中，并按照文稿所述培养细胞。接着，吸去各孔中的培养基，并用PBS洗涤。为使细胞脱离，将细胞与一毫升细胞解离试剂在37摄氏度下孵育五分钟。

用1毫升添加了10% FBS的DMEM中和细胞解离试剂。然后将孔内液体收集至15毫升离心管中。通过离心沉淀细胞，并用PBS洗涤细胞沉淀一次或两次。

吸出所有上清液，管中残留约100微升。用300微升PBS重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管后，置于室温避光处保存。

使用文本稿件中所述的带通滤光片设置，通过流式细胞仪分析细胞。使用细胞解离试剂分离约100万个细胞，并按照先前所示方法将细胞离心沉淀。用含10%胎牛血清的DMEM中和细胞悬液，并将悬液收集至15毫升离心管中。

在室温下用 1 毫升 1.6% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。在 -20°C 下用 1 毫升预冷的 90% 甲醇透化细胞 20 分钟。然后将样品加入 1 毫升封闭缓冲液中封闭，并用 PBS 通过离心洗涤细胞，操作如图所示。

为了检测不同的线粒体复合物及亚基，将细胞与文中所述的相应一抗在37℃下孵育30分钟。用PBS洗涤细胞一次后，加入二抗孵育30分钟。孵育结束后，洗涤细胞并重新悬浮于PBS中，操作如图所示。

将细胞悬液转移至预冷避光的1.5毫升微量离心管中，置于冰上。随后，使用流式细胞仪分析细胞，通过530/30带通滤光片检测并筛选信号。针对每种细胞亚群，选择直方图进行分析，测定不同滤光通道的中位荧光强度（MFI）。

根据文稿中所述方法，计算TMRE水平、MMP ROS复合物亚基和TFAM的特异性数值。采用流式细胞术和活细胞检测来分析线粒体膜电位（MMP）、线粒体体积及活性氧（ROS）水平。在POLG突变的多巴胺能神经元中，观察到特异性MMP降低、特异性ROS升高，而线粒体体积、总MMP和总ROS未见变化。

POLG 星形胶质细胞的线粒体膜电位降低，但线粒体体积和活性氧水平无变化。采用流式细胞术和固定细胞检测MRC复合物亚基和TFAM的水平。多巴胺能神经元中复合物I和TFAM水平较对照组升高，但复合物II水平无变化。

POLG 星形胶质细胞显示出复合物 I、复合物 IV 以及特异性 TFAM 的减少。由于细胞密度也可能影响线粒体膜电位（MMP）以及线粒体总质量（MTG）与 MMP 荧光之间的关系，因此该现象具有细胞特异性。将本方案适配于其他细胞类型时，可能需要进行优化。在完成本操作步骤后，可进行基于显微镜的分析，例如共聚焦显微镜观察，从而提供线粒体结构的更多细节信息。

因此，尽管该策略用于检测已知线粒体疾病中多巴胺能神经元和星形胶质细胞的线粒体功能障碍，但这些技术也可应用于探索任何类型细胞和疾病中的线粒体功能。