一种用于高通量斑马鱼胚胎排列的3D打印模板

该方法可显著加快斑马鱼胚胎排列过程，使斑马鱼真正适用于高通量筛选。该技术的主要优势在于使用3D打印模板将斑马鱼胚胎预先排列至96孔或384孔板矩阵中，从而实现高效的微孔板制备流程。我们最初在通过手动挑选并将单个胚胎逐个移入模块化微孔板的各个孔中进行纳米颗粒筛选实验时，萌生了该方法的想法，并希望提高实验效率。

除了田宇之外，另一位研究生江 Yue 也将演示该操作流程。首先设计一个阵列模板，其布局为十二行八列的 96 孔格式，以适配标准的 96 孔板，具体设计方法见文本版操作指南。

使用精度为 0.1 毫米的 3D 打印机打印模板。模板的一些关键组件包括包埋室、包埋孔、真空室和进气/出气口。进行斑马鱼胚胎产卵实验时，首先使用透明塑料隔板将雄鱼和雌鱼分隔开。

然后，在产卵前一天，每个交配盒中放入一对雄鱼和一对雌鱼。在产卵当天早晨，移除隔板使雄鱼和雌鱼混合。随后将雄鱼和雌鱼移走，使用细网筛收集斑马鱼胚胎。

用250毫升的胚胎培养水清洗胚胎。将收集的胚胎转移至含有霍尔特弗雷特溶液的培养皿中。使用体视显微镜去除死亡和未受精的胚胎。

将胚胎置于28.5°C的培养箱中。在受精后4小时，观察胚胎并移除任何死亡或不健康的胚胎。此时胚胎已准备好进行下一步操作。

将模板用 500 毫升去离子水清洗两到三次，然后放入干燥烘箱中干燥五分钟。接着，用封膜胶带将底部腔室密封。通过模板底部的出气口连接真空泵，以在封膜密封的腔室内产生负压。

使用塑料移液管将约150个胚胎放入模板中。水平摇动整个模板，直至每个孔中均有一个胚胎被固定。在此步骤中，必须逐一检查每一个可用的斑马鱼胚胎，确保其位置正确。

如果霍尔特弗雷特缓冲液过少，可通过轻轻摇动模板来添加额外的缓冲液。弃去多余的霍尔特弗雷特溶液以及未被固定在孔中的胚胎。关闭并断开真空泵的连接。

将标准的96孔板倒扣在模板上，同时旋转两者。轻敲模板底部，或连接气源出口至压缩气体除尘罐，以将模板中所有滞留的胚胎转移至96孔板中。最后，移除密封膜，并用500毫升去离子水自上而下冲洗模板三次，以备后续使用。

此处显示的是使用模板排列的96孔板的部分图像。相反，此图像显示的是手动排列的96孔板的部分图像。此处展示了通过手动和模板排列方法点板后胚胎的整体健康状态。

根据胚胎的孵化率、存活率和畸形率，两种情况下均未观察到对胚胎整体健康产生显著影响。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到三分钟内完成一个96孔或384孔板的制备。该技术建立后，为研究人员充分利用这一模式生物的新特性、真正实现体外高通量筛选奠定了基础。