结合单分子操控与成像技术研究蛋白质-DNA相互作用

本实验的总体目标是观察单个DNA结合蛋白与DNA分子之间的动态相互作用。通过在自行搭建的显微镜系统中结合两种单分子技术——双光镊和荧光显微镜技术，实现这一目标。该系统还配备了明场照明，用于样品的可视化以及纳米级的样品稳定。

第二步，构建集成于微流系统中的多通道流动池，以实现最多四股层流，高效捕获并组装实验所需的所有组分。接下来，组装单分子结构以开展实验。首先，在第一个通道中利用双光镊捕获两个涂覆有肌联蛋白片段的微球。

然后将两个被捕获的微珠移动到第二个通道，以使两端均标记有生物素的DNA模板得以连接。在第三个通道中通过DNA力学拉伸分析检测是否存在单个DNA分子。最后，将名为DNA哑铃结构的微珠-DNA-微珠复合物移至含有荧光标记乳糖阻遏蛋白的蛋白通道中。

实验结果展示了单个LAC眼分子在单个拉伸DNA分子上的扩散和特异性结合，并量化了LAC眼分子运动的动力学参数。与现有的单分子方法相比，该技术的主要优势在于能够控制施加于DNA分子的张力，能够精确定位结合蛋白在数纳米稳定区域内的运动轨迹，以及能够在远离盖玻片表面的环境中操作。该方法有助于回答有关蛋白质-DNA相互作用的关键科学问题，特别是基因表达调控的力学机制，以及蛋白质沿DNA进行靶标搜寻过程中的扩散动力学。

该方法的演示对于展示流动池样品处理以及beat DNA微珠结构组装的实际操作方面非常有用。本视频将首先演示如何利用固定在盖玻片表面的微珠作为参考，检测两个捕获激光的指向稳定性。有关光镊装置的设计与构建的详细信息，可参见配套的实验方案文本。

使用 24 × 60 毫米的盖玻片将两微升二氧化硅微珠均匀涂布在 24 × 32 毫米盖玻片表面。使用两段双面胶带，将 24 × 32 毫米的盖玻片固定在显微镜载玻片上，以制成流动池。

用 50 毫摩尔的磷酸盐缓冲液填充流动池，并用硅脂密封。在明场显微镜下观察单个二氧化硅微球，放大倍数约为 2000 倍。视野范围应约为 7 × 5 微米，图像采集分辨率为 768 × 576 像素，使微球图像的直径约为 190 像素。通过反馈软件补偿热漂移，该软件根据图像的质心计算 XY 位置，根据衍射环计算 Z 位置，并校正漂移。

通过压电平台以纳米级或更高的精度移动，使左侧光镊的中心与微珠中心重合，并利用四象限探测器的光电二极管（QDP）测量位置噪声及其标准差。对右侧光镊重复该测量。位置噪声的标准差应在几纳米范围内，以实现对DNA结合蛋白的精确定位，进而制备流动池。

首先使用金刚石钻头在一块76 × 76 × 1毫米的显微镜载玻片上钻出直径为1毫米的孔，以形成四个入口和一个出口。这将允许最多四股并行的缓冲液流。

每个包含实验所需的珠子、荧光标记的DNA蛋白以及成像缓冲液等不同组分。用乙醇清洁显微镜载玻片，并将带有O型圈的端口居中放置，同时将粘合环置于载玻片上，围绕在通路孔周围。此步骤中必须佩戴手套，以避免留下指纹，否则会影响粘合过程。

借助第二个载物片将纳米端口夹紧到载玻片上，并将其放入预热至180摄氏度的烘箱中加热一小时，以确保完全固定。在此期间，用纸张绘制出流体池的轮廓图案。通道宽度应约为三毫米，并与显微镜载玻片上的孔位相匹配。

将图纸放在两片 perfil 上方，用手术刀沿绘制的轮廓进行锋利而连续的切割。去除形成的任何凸起，弃去下方的 parfum 层，该层仅用于确保支撑面清洁。接着，将载有已固定纳米端口的显微镜载玻片倒置放入金属支架中。

小心地将石蜡室轮廓与孔对齐，确保石蜡不会突出到腔室盖的入口和出口之外，并使用清洁的显微镜盖玻片仔细去除腔室周围多余的石蜡。将两个预先加热至120摄氏度的加热块置于流体池上方，以对其施加均匀的压力。让石蜡膜熔化约25分钟。

下一步是准备压力储液罐和缓冲液容器。压力储液罐由有机玻璃制成，最多可容纳六个缓冲液容器。首先，连接缓冲液容器出口处的截止阀，通过将阀杆置于垂直位置来打开缓冲液流动，或通过顺时针旋转至水平位置来关闭流动。

实验过程中，将流动池安装在显微镜载物台上。然后通过聚醚醚酮（PEEK）管路和无法兰接头，将截止阀连接至流动池的入口。PEEK管路的内径约为150微米，在PEEK管路与流动池的纳米端口组件之间，使用约3厘米长、内径约为500微米的氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管路作为连接。

这一步至关重要，可降低缓冲液在腔室入口处的流速，避免流动池破裂或纳米进样口从玻璃表面脱落。然而，若仅使用内径较大的管路，则需要消耗大量生物样本。将流动池出口连接至一个敞口的Falcon管，使其处于大气压下。

此管用于收集从流室中流出的缓冲液。开始此操作时，向每个缓冲液容器中加入一毫升缓冲液A，并施加200毫巴压力以冲洗连接管路和流室。压力控制系统具备此功能。

最后，调节压力储液罐内的气压。检查是否存在气泡，因为气泡可能干扰流动的平稳性。轻轻敲击出口管以去除残留的气泡，将压力降至20毫巴，并确认所有通道和管路均无气泡，且缓冲液在各通道中的流速相近。

将样品制备至终体积为 300 微升。本实验使用经链霉亲和素包被的聚苯乙烯微球、两端生物素标记的线性 DNA（其含有乳糖阻遏蛋白特异性结合的靶序列）以及荧光标记的乳糖阻遏蛋白。按照以下顺序将各样品依次加入注射器装置的不同通道：第一个通道加入微球，第二个通道加入 DNA，第三个通道加入成像缓冲液，第四个通道加入标记的蛋白。

将流速调至20毫巴，打开截止阀，使样品进入流道。这一过程在微珠通道中很容易观察到。在明场照明下对第一个通道进行成像的同时，开启两个光镊，分别在每个光阱中捕获一个聚苯乙烯微珠。

迅速转移到第二个通道，以避免其他微珠落入光镊捕获区域。请注意，当微珠流停止时，即可明显观察到微珠已进入DNA通道。使用一个AO光学偏转器或OD移动，将一个被捕获的微珠在另一个微珠附近前后移动，从而使流场拉伸的DNA能够连接在两个光镊捕获的微珠之间。

当DNA哑铃结构形成后，静止的微球将开始跟随由光镊主动来回移动的微球运动。迅速移至缓冲液通道并关闭缓冲液流动。进行力-伸展曲线分析，以确认单个DNA分子的存在。

通过在测量DNA张力的同时将两个小球分开来实现此过程。获得单个DNA哑铃结构后，再次开启流体，将哑铃移至蛋白质通道。切换至宽场荧光显微镜以监测标记的乳糖阻遏蛋白与DNA的相互作用，随后关闭流体并开始采集数据。

该方法能够检测单个乳糖阻遏蛋白或 lac 眼（lac eye）分子与拉伸 DNA 分子的相互作用。在此代表性 CH 图中，一个 lac 眼分子在非特异性 DNA 序列上扩散，而另一个 lac 眼分子则特异性结合于 DNA 分子中心位置的一个操纵序列。该图显示了两个 lac 眼分子沿两个光镊中心连线方向的位置。

随着时间的变化，通过此处所示的径向对称中心算法确定了分子的位置。图中显示的是单个 lac 偶联分子沿拉伸的 DNA 分子扩散时，均方位移（MSD）随时间变化的曲线图。通过数据的线性回归可直接获得该蛋白质的扩散系数。操控技术与成像技术的结合是一种强大的方法，能够对单个生物大分子（如 DNA、RNA 或细胞骨架丝）实现机械控制，同时精确定位与该聚合物相互作用的单个蛋白质分子。

在进行本实验操作时，需注意将单分子操控与成像技术相结合，要求对实验装置进行精心设计，以确保悬浮聚合物达到纳米级的稳定性。另一方面，还需合理设计生物探针，以保证捕获用G激光与荧光探针之间具有适当的空间分离。具体细节请参见配套的实验方案文本。

观看本视频后，您应充分了解如何在两个光镊之间组装DNA分子，从而完成该构建体的组装。使用我们提供详细描述的多通道流动池可更好地实现这一组装过程。我们还介绍了如何优化缓冲液流速以及如何去除气泡，否则这些气泡可能会影响您的实验结果。

在组合文本方案中，您可找到使用生物素TE对DNA进行标记的方案，这是与链霉亲和素包被的微珠进行组装所必需的步骤，同时也包括对蛋白质进行标记的方案。最后，我们详细说明了定量分析单个乳糖阻遏蛋白在拉伸的DNA分子上的结合与扩散的逐步操作流程。